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Artikel und Hintergründe zum Thema

Live-Cell-Imaging

Visualisierung der molekularen Dynamik des Lebens

Dr. Thomas Veitinger und Dr. Zhongxiang Jiang, Leica Microsystems

Das Verständnis komplexer und schneller zellulärer Prozesse ist ein wichtiger Schritt zur Erforschung biologischer Vorgänge. Daher rücken dynamische Prozesse wie z.B. die Zellmigration, morphologische und biochemische Veränderungen von Zellen, wie Änderungen der intrazellulären Ionenzusammensetzung, immer mehr in den Vordergrund der heutigen biomedizinischen Forschung.

Da diese Vorgänge dynamisch sind, müssen sie in lebenden Präparaten (z.B. Zellkultur, Organschnitte) über die Zeit beobachtet werden. Eine Möglichkeit, diese anspruchsvollen Aufgaben zu lösen, ist der Einsatz bestimmter optischer Methoden, die unter dem Oberbegriff Live-Cell-Imaging zusammengefasst werden.

Live-Cell-Imaging, oder Lebendzellmikroskopie, erlaubt die Untersuchung dynamischer Prozesse in lebenden Zellen, statt einen "Schnappschuss" des aktuellen Zustandes wiederzugeben - aus Momentaufnahmen werden Filme. Live-Cell-Imaging liefert dementsprechend räumliche und zeitliche Informationen über dynamische Ereignisse in einzelnen Zellen, in Zellnetzwerken (in situ) oder sogar in ganzen Organismen (in vivo). Somit können mögliche Antworten auf Fragen in der Zellbiologie, Krebsforschung, Entwicklungsbiologie und in den Neurowissenschaften gefunden werden. Große Fortschritte in der Elektronik, Optik und Molekularbiologie in den letzten Jahren haben Wissenschaftlern den Zugang zu Live-Cell-Imaging-Methoden wesentlich erleichtert.

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Geeignete Methoden für Live-Cell-Imaging

Konfokale Lebendzellabbildung von Arabidopsis; endoplasmatisches Retikulum: GFP wird grün markiert, selbstfluoreszierende Chloroplasten rot, Transmission blau. Eine solche Abbildung kann als Basis für eine FRET- oder FRAP-Analyse dienen.

Für die Bildgebung lebender Zellen werden diverse mikroskopische Techniken herangezogen. Oft werden Kontrastverfahren wie z.B. Phasenkontrast oder Differential Interference Contrast (DIC) zur Beobachtung von Zellwachstum, von Zellverbänden oder Zellbewegungen über die Zeit eingesetzt. Weit verbreitet ist es auch, von größeren Proben wie zum Beispiel Zebrafisch-Embryonen während der Entwicklung Zeitreihen aufzunehmen. Hier wird oft mit Stereomikroskopen oder Makroskopen gearbeitet. In den letzten Jahrzehnten spielen auch Fluoreszenzverfahren eine sehr wichtige Rolle. Zusätzlich hat durch die rasanten Fortschritte in der Konfokalmikroskopie in der biologischen und biomedizinischen Forschung ein Perspektivwechsel von der zweiten in die dritte Dimension stattgefunden. Im Folgenden geben wir eine kurze Übersicht der gängigsten Verfahren für Live-Cell-Imaging.

Ion-Imaging - Beobachtung von Ionenkonzentrationen in lebenden Zellen

Ein häufig angewendetes Verfahren ist das Ion-Imaging, also das Beobachten der Konzentrationsänderungen und Verteilung von z.B. Calcium, Chlorid und Magnesium in Zellen oder Geweben über die Zeit. Hierzu werden speziell entwickelte Fluoreszenzfarbstoffe oder Proteine eingesetzt, die ihr Emissionsverhalten bei Bindung mit z.B. Calcium ändern und dadurch die Beobachtung dynamischer Änderungen in den Ionenkonzentrationen von Zellen ermöglichen. Da die Ionenzusammensetzung in Zellen für eine Vielzahl wesentlicher Zellfunktionen wie z.B. die Erregbarkeit von Neuronen, Gentranskription und Zellmotilität (u.v.a.m.) entscheidend ist, ist die räumliche als auch zeitliche Regulierung intrazellulärer Ionen von großem Interesse für die biomedizinische Forschung. Mit speziellen Fluoreszenzfarbstoffen ist auch die Darstellung intrazellulärer pH- bzw. Spannungswerte möglich.

Ein besonderes Verfahren zur Darstellung von Änderungen der Ionen-, pH- oder Spannungswerte bieten ratiometrische Methoden. Diese erlauben die genaue Bestimmung z.B. des intrazellulären Calciumgehaltes, wohingegen herkömmliche Methoden nur die Beobachtung relativer Änderungen zulassen.

FRET - Quantifizierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen

Zum Nachweis dynamischer Protein-Wechselwirkungen können FRET-(Förster-Resonanz-Energie-Transfer-) und BRET-(Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer-)Ereignisse in Lebendzellexperimenten dargestellt werden. FRET eignet sich gut zur Quantifizierung molekularer Bewegungen wie z.B. Protein-Protein-Wechselwirkungen, Protein-DNA-Wechselwirkungen sowie Konformationsänderungen von Proteinen. Dazu werden normalerweise Varianten von GFP (grün fluoreszierende Proteine) insbesondere CFP und YFP (cyan bzw. gelb fluoreszierende Proteine) eingesetzt, die sich jeweils mittels molekularbiologischer Methoden an die zu untersuchenden Proteine koppeln lassen. Anschließend wird das CFP-Molekül mit Fluoreszenzlicht angeregt. Bei entsprechendem Abstand der zu untersuchenden Proteine (

FRAP - Beobachtung von Protein- und Vesikeltransportbewegungen

Eine häufig verwendete Methode zur Beobachtung von Protein- bzw. Vesikeltransportvorgängen ist Fluorescence Recovery After Photo-bleaching (FRAP). Hier wird ein zu untersuchendes Protein (d.h. ein Protein, dessen Bewegung beobachtet werden soll) mit einem fluoreszierenden Protein (meist GFP) versehen. Im Normalfall fluoresziert die ganze Zelle, da das Protein in der ganzen Zelle reichlich vorhanden ist. In einem nächsten Schritt wird ein bestimmter Zellbereich, wie z.B. Axone oder Dendriten von neuronalen Zellen, hohen Lichtintensitäten ausgesetzt (meistens Laserlicht), so dass die Fluoreszenz in diesem bestimmten Bereich zerstört (geblichen) wird. Da sich das zu untersuchende Protein bewegt, wandern Proteine aus anderen Zellteilen mit einer bestimmten Geschwindigkeit in den gebleichten Bereich, und es kommt zu einer Regenerierung der Fluoreszenz in dieser Region. Dadurch können Forscher Einsichten in intrazelluläre Transportbewegungen gewinnen.

TIRF - Beobachtung von Prozessen nahe der Zellmembran

Ein besonderes Verfahren zur Beobachtung von Ereignissen, die in oder nahe der Plasmamembran einer Zelle stattfinden, ist die TIRF-(Total Internal Reflection-)Mikroskopie. Durch die Verwendung eines evaneszenten Feldes (evaneszente Felder treten hinter Grenzflächen auf, an denen Wellen reflektiert werden) zur Fluorochromanregung, welches nur 60 bis 250 nm in die Zelle eindringt, wird mit der TIRF-Mikroskopie eine unübertroffene Z-Auflösung erreicht. Dies ermöglicht die Darstellung von Ereignissen nahe der Zellmembran (die in direktem Kontakt mit dem Deckglas ist), wie z.B. Molekültransport zur Plasmamembran, ohne aber das Fluoreszenzsignal durch Signale von innerhalb der Zelle zu überdecken. Dies ist ein großer Vorteil bei der Beobachtung von kleinen Strukturen wie z.B. Vesikeln, die andernfalls kaum sichtbar wären.

Photoaktivierung - Beobachtung von Genexpression sowie Proteintransport

Bei der Photoaktivierung handelt es sich um eine erst in jüngerer Zeit entwickelten Methode. Dabei werden bestimmte Bereiche einer Zelle bzw. eines ganzen Organismus selektiv fluoreszenzmarkiert. Zur Photoaktivierung werden speziell entwickelte Farbstoffe oder fluoreszierende Proteine wie z.B. photoaktivierbares grün fluoreszierendes Protein (paGFP) oder Kaede eingesetzt. Erst mit Hilfe von Licht bestimmter Wellenlängen werden diese Marker aktiviert, dass sie wie herkömmliche Fluorophore fluoreszieren. In vielen Fällen werden diese fluoreszierenden Proteine an bestimmte zu untersuchende Proteine genetisch fusioniert, um deren Expression bzw. Transport zu beobachten. Zur weiteren Untersuchung des Proteins werden dann Methoden wie FRAP oder Particle Tracking angewendet.

MPE (Multi Photon Excitation) - Untersuchung von Prozessen in der Tiefe

Ergänzend zu in-vitro-Untersuchungen an Zellkulturen erfordert die moderne biologische Forschung echte in-vivo-Untersuchungen. Das Erforschen von Prozessen, die innerhalb eines lebenden Organismus wie z.B. einer Maus ablaufen, gestaltet sich jedoch schwierig, da die zu untersuchenden Zellen oftmals einige Mikrometer bis Millimeter tief liegen und daher schwer vom Anregungslicht für die Fluoreszenzmikroskopie erreichbar sind. Die Multiphotonenanregung-(MPE-)Mikroskopie ermöglicht ein tieferes Eindringen in das Gewebe (v.a. Gehirn), da das langwellige, fast infrarote Anregungslicht im Gegensatz zum sonst kurzwelligen, zur Einzelphotonenanregung verwendeten Licht weniger gestreut wird. Durch den nichtlinearen Charakter des MPE-Verfahrens werden Photobleichung und Phototoxizität auf den Fokusbereich begrenzt. Dies ist für Langzeitbeobachtungen ein enormer Vorteil. Mit der richtigen Vorbereitung und Einrichtung des Mikroskops wurden nachweislich Gewebetiefen von einigen Millimetern erreicht. Wegen der genauen Lokalisierung der Anregung eignet sich diese Methode auch für die Photonenmanipulation. Diese Methode findet in der Neurobiologie breite Anwendung.

STED - Untersuchung der Zelldynamik im Nanometerbereich

Mit der Stimulated Emission Depletion-(STED-)Mikroskopie können Strukturen jenseits der optischen Auflösungsgrenze von 200 bis 250 nm lateral untersucht werden. Bei diesem Verfahren wird der Bereich, der das Fluoreszenzsignal aussendet, unter die Beugungsgrenze verkleinert, indem ein räumlich modulierter Abregelaser eingesetzt wird. Damit können intrazelluläre Strukturen von 50 bis 70 nm erfolgreich abgebildet werden. Zur Untersuchung kleiner intrazellulärer Strukturen ist eine solche Auflösungssteigerung unabdingbar. Besonders für die Untersuchung von Kolokalisierungsereignissen kann die gesteigerte Auflösung ein realistischeres Ergebnis bieten. Im Vergleich zu anderen stochastischen Höchstauflösungsverfahren, wo das Bild mathematisch berechnet wird, ermöglicht das STED-Verfahrens eine relativ hohe Abbildungsgeschwindigkeit, was die Aufnahme von biologischen Prozessen in Zeitreihen ermöglicht. Somit können Zelldynamikstudien in Echtzeit und Hochauflösung ("Superresolution") durchgeführt werden.

FLIM - 3D-Messungen in lebenden Zellen

Fluorescent Lifetime Imaging (FLIM) hat den Vorteil, dass die gewonnen Daten nicht von der Intensität des Signals abhängig sind und daher nicht von häufig auftretenden Artefakten wie Photobleichung und Inhomogenitäten der Fluorophorkonzentration beeinflusst werden. Unter Verwendung der zeitkorrelierten Einzelphotonenzählung werden FLIM-Bilder aus den Daten der Einzelmoleküldetektion rekonstruiert. Die minimale Änderung der Fluoreszenzlebenszeit in Subnanosekunden, die charakteristisch für jedes Fluophor ist, kann erfasst und analysiert werden. FLIM bietet ein vielseitiges Verfahren zur Untersuchung verschiedenster extra- und intrazellulären Umweltänderungen, die sich auf die Fluoreszenzlebenszeit auswirken. Die FLIM-basierte FRET-Analyse ist gegenüber der Emissionsintensität unempfindlich und erhöht daher die Genauigkeit der quantitativen Daten.

CARS und SRS - markierungsfreie Methode anhand von Schwingungskontrast

Fast alle Fluoreszenzabbildungsmethoden zur Untersuchung lebender Zellen basieren auf der Genexpression fluoreszierender Proteine oder der Einbringung bestimmter Farbstoffe in die Zellen. Dies erfordert einen erheblichen technischen Aufwand und ist zeitaufwändig. Außerdem kann die Expression externer Gene einer Änderung der Mikroumgebung zur Folge haben, die die Daten von der physiologischen Wirklichkeit abweichen lässt. Coherent Anti-Stokes Raman Scattering-(CARS-)Mikroskopie und Stimulated Raman Scattering-(SRS-)Mikroskopie sind nichtlineare konfokale Verfahren, bei denen die Kontrasterzeugung nicht auf Fluoreszenzfarbstoffen beruht. Mit diesen markierungsfreien Methoden werden die Schwingungszustände spezifischer chemischer Bindungen zum Kontrastieren der Probe genutzt. Die Akkumulation spezifischer chemischer Bindungen in lebenden Organismen, wie z.B. die Lipide in der die Axone umgebende Myelin-Hülle, kann mit hoher Auflösung und ausgezeichnetem Signal-Rausch-Verhältnis ohne den Einsatz von Farbstoffen abgebildet werden.

Die Zukunft ist quantitativ

Die biologische Forschung hat das Alter der beschreibenden Untersuchung hinter sich gelassen und ist in ein Zeitalter der quantitativen Analyse getreten. Neue Lebendzellabbildungsverfahren entwickeln sich in Richtung höherer Auflösung, sowohl in räumlicher als auch in zeitlicher Hinsicht. Technologische Entwicklungen konzentrieren sich nun auf die quantitative Untersuchung einzelner Moleküle im Nanometerbereich und auf die Erfassung molekularer Reaktionen.

Kontakt:

Anja Schué
Leica Microsystems GmbH
Anja.Schue@leica-microsystems.com
www.leica-microsystems.com

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