Effiziente Probenvorbereitung

Duale Zentrifugation

Extraktionen, Zell- und Gewebeaufschluss, Vermahlen und Zerkleinern – was duale Zentrifugation alles kann, das zeigt Prof. Massing aus der F&E Lifescience Applications bei Hettich.

Bild 1: Duale Zentrifuge „ZentriMix 380 R“ und ZentriMix-Rotor (oben) sowie Darstellung des Funktionsprinzips (unten). © Hettich

Während analytische Bestimmungen in vielen Bereichen in den letzten Jahren deutlich schneller und sensitiver geworden sind, gilt dies leider nicht für die meist notwendige Probenvorbereitung. Extraktionen, Zell- und Gewebeaufschluss, Vermahlungen und Zerkleinerungen im Vorfeld der eigentlichen Analyse sind auch heute noch zeitaufwändige Prozesse, die – da sie oft manuell durchgeführt werden – nicht vollständig reproduzierbar sind. Wir konnten zeigen, dass Effizienz und Reproduzierbarkeit von Probenvorbereitungen mit Hilfe der „dualen Zentrifugation“ erhöht werden können.

Eine duale Zentrifuge ist das „Gegenteil“ einer normalen Zentrifuge, ein Gerät zur Vermischung statt zur Separierung von Proben. Bei der dualen Zentrifugation werden die Proben während der Zentrifugation zusätzlich um ihre eigene Achse gedreht. Dadurch ändert sich kontinuierlich die Richtung der starken Zentrifugalbeschleunigung in den Probengefäßen, wodurch das Probenmaterial sehr schnell in den Gefäßen bewegt wird (Bild 1). Die Probenbewegungen sind von der Geometrie der Probengefäße und ihrer Positionierung in der dualen Zentrifuge abhängig und bei länglichen Gefäßen mit den Probenbewegungen in einem Horizontalschüttler zu vergleichen. Allerdings erreichen selbst die leistungsfähigen Schüttler nur eine Probenbeschleunigung von max. 50 x g, während mit Hilfe der dualen Zentrifugation bis zu 1 000 x g erreicht werden, was einen vielfach höheren Energieeintrag in die Proben zur Folge hat.

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Dieser bislang unerreicht hohe Energieeintrag erlaubt die Durchführung (i) sehr effizienter Extraktionen, (ii) die Vermahlung bzw. Zerkleinerung von Proben inklusive des (iii) schnellen und schonenden Gewebeaufschlusses, (iv) schnelles Lösen von schwerlöslichen Substanzen, (v) eine sehr rasche und gleichzeitig schonende Nanovermahlung sowie (vi) die Herstellung von Liposomen und Emulsionen durch Homogenisation. Im Folgenden wird auf die für die Probenvorbereitung relevanten Anwendungen (i) – (iii) eingegangen.

Bei Fa. Hettich ist mit der Zentrimix 380 R erstmals eine duale Zentrifuge für den Laboreinsatz entwickelt worden, mit der in unterschiedlich großen Gefäßen Ansätze von wenigen Milligramm bis in den 100 g-Bereich prozessiert werden können. Alle Prozesse können in geschlossenen (und sterilen) Einmal-Gefäßen durchgeführt werden; eine leistungsfähige Kühlung garantiert den bestmöglichen Schutz empfindlicher Proben. Hohe Probenzahlen stellen kein Problem dar, da bis zu 40 Proben parallel verarbeitet werden können. Da im Rahmen der Probenvorbereitung oft auch klassische Zentrifugationsschritte durchzuführen sind, kann die Zentrimix 380 R bei Nutzung normaler Rotoren auch als leistungsfähige Kühlzentrifuge eingesetzt werden.

Extraktionen

Ein gutes Beispiel für die Vereinfachung von Extraktionen mit Hilfe der dualen Zentrifugation ist die weit verbreitete Pestizidextraktion aus Lebensmitteln oder Tierfutter, die sogenannte QuEChERS-Extraktion (Quick, Easy, Cheap, Efficient, Rugged & Save). In 50 ml-Röhrengefäßen werden die homogenisierten Lebensmittel mit Acetonitril (ACN) in einem mehrminütigen Schüttelschritt extrahiert. Da sich die Phasen nicht gut trennen, wird in einem weiteren Schritt ein MgSO4-haltiges Salzgemisch zugegeben und erneut geschüttelt. Der Effekt ist, dass das MgSO4 nicht nur einen Teil des Wassers bindet, sondern auch der ACN-Phase dort gelöstes Wasser entzieht. Da sich zudem ein Teil des Salzes in der wässerigen Phase löst und so die Dichte erhöht, trennt sich die organische Phase gut ab und wird nach kurzer Zentrifugation der HPLC-MS-Analytik zugeführt. Die QuEChERS-Extraktion muss in zwei Schritten erfolgen, da bei Zugabe des Salzes bereits im ersten Schritt dieses mit dem Wasser des Lebensmittels eine feste Matrix ausbilden würde, wodurch die homogene Extraktion der Pestizide erheblich beeinträchtigt wird.

Bild 2: Vergleich der Arbeitsschritte bei der klassischen sowie der ZentriMix-QuEChERS-Extraktion. Rechts: Vial nach abschließender Phasentrennung (v. oben n. unten: organische Phase, Interphase, wässerige Phase, ungelöstes Salz). © Hettich

Bei Durchführung der QuEChERS-Extraktion mit Hilfe der Zentrimix 380 R kann diese in nur einem einzigen Schritt durchgeführt werden, da sich durch die extrem starke Beschleunigung der Probe während der Extraktion keine feste Salzstruktur ausbilden kann. Dies spart nicht nur einen Arbeitsschritt, die Extraktion selber benötigt auch weniger Zeit, zeigt sehr hohe Extraktionsausbeuten und ist hoch reproduzierbar. Da insgesamt sechs Proben parallel extrahiert werden können, wird weitere Zeit eingespart.

Zell- und Gewebeaufschluss

Die Durchführung des Zell- und Gewebeaufschlusses in der roten, grünen oder blauen Biotechnologie für die anschließende Gewinnung von DNA, RNA, Proteinen, Peptiden oder bestimmter Metaboliten erfolgt heute oft in vorkonfektionierten 2 ml-Twist-Top-Vials, die mit einer Homogenisierhilfe befüllt sind (z. B. Keramikkugeln, Quarzsand). Dazu wird das Gewebe, z. B. Tierorgane oder Pflanzenteile, in die Vials gegeben und in dafür bestimmten Schüttlern für eine kurze Zeit intensiv geschüttelt.

Dieser Vorgang kann auch sehr effizient mit Hilfe der Zentrimix 380 R durchgeführt werden. Die sehr starke Beschleunigung des Probenmaterials führt zu einem sehr raschen Aufschluss/Zerkleinerung der Gewebe und hohen Ausbeuten der Analyten. Durch die leistungsfähige Kühlung des Geräts ist auch die Verarbeitung von empfindlichen Proben möglich. Bis zu 40 Proben können parallel aufgeschlossen werden. Eine separate Zentrifuge zum Abzentrifugieren der Proben ist nicht nötig, da die Zentrimix 380 R auch als Zentrifuge nutzbar ist.

Vermahlungen/Zerkleinerungen

Eine wichtige Voraussetzung für die Extraktion von bestimmten Analyten oder für die Nukleinsäure-Extraktion ist eine ausreichende Vermahlung bzw. Zerkleinerung des (oft trockenen) Probenmaterials, wie z. B. Getreide. Die hierfür eingesetzten typischen Labormühlen müssen zur Vermeidung von Kreuzkontaminationen nach jeder Vermahlung gründlich gereinigt werden.

Bild 3: Vermahlung von Braugerste im geschlossenen Gefäß (vor und nach der Vermahlung). © Hettich

Vermahlungen/Zerkleinerungen mit Hilfe der Zentrimix 380 R werden in geschlossenen, hochreinen und sterilen 2 bzw. 50 ml-Einweg-Gefäßen durchgeführt, wodurch Kreuzkontaminationen sicher vermieden werden und das Gerät nach der Vermahlung nicht gereinigt werden muss. Zudem können die Proben ohne erneute Öffnung der Gefäße gelagert oder direkt in den Mahlgefäßen extrahiert werden (siehe oben). Für die Vermahlung besonders harter Proben (Erze etc.) steht ein passendes Mahlgefäß aus gehärtetem Stahl zur Verfügung.

AUTOR
Prof. Dr. Ulrich Massing
Abt. F&E Lifescience Applications
Andreas Hettich GmbH & Co KG, Freiburg
Tel.: 07461 705 2103
ulrich.massing@hettichlab.com

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