Life Sciences Innovations

LC/MS-MS-Quantifizierung von Mykotoxinen

Online-SIVA direkt im Autosampler
Die gefürchteten Matrix-Effekte in der LC/MS sind am effizientesten mit der Stabilisotopenverdünnungsanalytik (SIVA; engl. SIDA) in den Griff zu bekommen. Moderne Probenaufgabesysteme helfen, den Verbrauch des isotopenmarkierten Standards drastisch zu reduzieren. Speziell beim sog. "Dilute & Shoot"-Ansatz kann der teure interne Standard in einem programmierbaren Autosampler kurz vor der Injektion mit der Probe vermischt und gemeinsam dosiert werden. Es wird so nur das absolute Minimum der kostbaren gelabelten Referenzsubstanzen verbraucht.


Mykotoxine bedrohen als gefährliche Agrarkontaminanten die Gesundheit von Mensch und Tier. Nach Schätzung der WHO sind ca. 25 % der Welt-Nahrungsproduktion mit diesen toxischen, sekundären Stoffwechselprodukten von Schimmelpilzen kontaminiert. Die Zugehörigkeit der wichtigen und gesetzlich geregelten Mykotoxine zu sehr unterschiedlichen chemischen Gruppierungen erfordert für ihre analytische Kontrolle eine Reihe von klassischen Analysentechniken wie HPLC (UV-DAD; FLD) und GC (ECD; MSD), teilweise auch mit diversen Derivatisierungen. Viele dieser klassischen Verfahren haben sich in Verbindung mit selektiven Clean-up-Verfahren wie SPE und insbesondere IAC (Immuno-Affinitäts-Säulen) zu Normmethoden entwickelt. Zugunsten einer rascheren und kostengünstigeren Analytik geht der Trend allerdings sehr stark zu Multimethoden mittels LC/MS-MS.

Anzeige

Ziel war die Entwicklung einer Stabilisotopenverdünnungs- analytik (SIVA) für eine Reihe von Mykotoxinen. Die Multimethode sollte sich durch eine weitgehende Vereinfachung der Probenvorbereitung, automatisierte Zugaben der isotopenmarkierten internen Standards und deren Verbrauchs- und damit Kostenreduktion auszeichnen.


„Dilute and Shoot“

Die große chemische Vielfalt aller Zielanalyten (unpolar bis ionisch, sauer bis basisch) macht schon eine gemeinsame Extraktion zur Herausforderung und ein gemeinsames Clean up praktisch unmöglich. Zum Start der Entwicklung einer Multitoxinmethode wurde ein Großteil der Mykotoxine mit Grenzwertregelungen in folgender Zusammenstellung ausgewählt:
¿ A-Trichothecene: HT-2 Toxin (HT2), T-2 Toxin (T2), Monoacetoxyscirpenol (MAS) und Diacetoxyscirpenol (DAS).
¿ B-Trichothecene: Deoxynivalenol (DON), Nivalenol (NIV), 3-Acetyldeoxynivalenol (3ADON), 15-Acetyldeoxynivalenol (15ADON) und Fusarenon-X (Fus X).
¿ Aflatoxin B1 (Afl B1), B2 (Afl B2), G1 (Afl G1) und G2 (Afl G2).
¿ Fumonisin B1 (Fum B1) u. Fumonisin B2 (Fum B2).
¿ Zearalenon (ZON) und Ochratoxin A (OTA).

Die geforderte hohe Sensitivität und Selektivität wird praktisch nur mit der Tandem-Massenspektrometrie als gemeinsames Detektionsprinzip erfüllt. Soll auch die Probenvorbereitung minimiert werden, bleibt nur noch der ¿Dilute and Shoot¿-Ansatz. Darunter versteht man die radikale Reduktion des Analysenablaufs auf die Extraktion mit Verdünnung des Rohextraktes und die abschließende Messung (ohne Clean up) in einem hochselektiven Analysensystem. D.h. für die Mykotoxinanalytik, dass der Rohextrakt (z.B. 25 g Einwaage in 100 ml Acetonitril/Wasser/Essigsäure 79/20/1) mit Wasser/Acetonitril verdünnt und direkt am LC/MS/MS vermessen wird [1]. Der Verdünnungsfaktor und die resultierende Lösungsmittel-Zusammensetzung richten sich nach den auferlegten Anforderungen und der Nachweisstärke des Tandem-MS. Unabhängig von dessen Bauart (QqQ, QqTOF, etc.) verschiebt sich die Grundproblematik in die Ionenquelle des Massenspektrometers. Ebenfalls großteils unabhängig von der Ionisationstechnik (ESI, APCI, Multimode-Quelle, APPI, etc.), stellen sich mehr oder weniger starke sog. Matrixeffekte ein.

Die Strategien gegen diese gefürchteten Matrix-bedingten Veränderungen des MS-Response können in Reduktionsmaßnahmen wie Clean up, chromatographische Abtrennung und Verdünnung, etc. [2] beziehungsweise Kompensationstechniken wie Standardaddition, Echo-Peak-Technik, strukturverwandte interne Standards bzw. isotopenmarkierte interne Standards [3] eingeteilt werden.

Die effizienteste und eleganteste Variante davon ist die sog. Stabilisotopenverdünnungsanalytik mit voll 13C-markierten Analogen der Zielanalyten. Üblicherweise sollten interne Standards vor kritischen Verfahrensschritten, wie Clean up, Derivatisierung, etc. zudosiert werden. Durch zwangsläufig notwendige Aliquotierungen resultiert daraus ein hoher Verbrauch an kostspieligen, isotopenmarkierten Referenzsubstanzen.

Die Dotierung der gelabelten internen Standards zur Einwaage oder aber auch zu einem Rohextraktaliquot ist nicht nur extrem teuer, sondern oft auch unnötig. Im Fall der Mykotoxine genügt die Dosierung des internen Standards (IStd) zur endgültigen Messlösung. Da diese ohnehin meist eine Verdünnung des Rohextraktes ist, kann die Verdünnung gleich mit der Lösung des internen Standards in einem Schritt erfolgen. Hält man dieses Volumen entsprechend klein, reduzieren sich die Kosten des IStd deutlich. Bei gleichzeitiger Maximierung des Injektionsvolumens kann die Wirtschaftlichkeit noch einmal deutlich gesteigert werden. Dabei muss allerdings der Anteil an organischem Lösungsmittel berücksichtigt bzw. angepasst werden. Nach umfangreichen diesbezüglichen Optimierungen haben sich 40 µl Probenaufgabevolumen mit einem organischen Lösungsmittelanteil von 10 % bestens bewährt [4].


SIVA direkt im Autosampler

Selbst bei guter Nutzung des teuren internen Standards durch kleine Messlösungsvolumina, wird mit der restlichen Messlösung aber noch immer ein Großteil verschwendet, denn je nach Autosamp-ler-System muss aus technischen Gründen im Autosampler-Fläschchen (AS-Vial) deutlich mehr Flüssigkeit vorhanden sein als tatsächlich injiziert werden kann. Mit dem neuartigen ¿Dilute & Shoot¿-Ansatz in der LC/MS-MS¿Technik ergeben sich ganz neue Möglichkeiten der Stabilisotopenverdünnungsanalytik.

Da die gefürchteten Matrixeffekte nur in der Ionenquelle des Massenspektrometers auftreten, ist es ausreichend, die teuren isotopenmarkierten Standards erst direkt bei der HPLC-Injektion zu dosieren. Die kostengünstigste Variante ist dabei die automatisierte Zusammenführung der notwendigen Menge an gelabeltem Standard mit dem Probeninjektionsvolumen direkt in der Autosampler-Spritze bzw. Probenschleife. So wird exakt nur noch jene minimalste Menge an kostbarem IStd verbraucht, die tatsächlich ins Massenspektrometer gelangen muss. Dieser ¿radikale Minimalismus¿ kann mit modernen, frei programmierbaren Autosamplern (AS) realisiert werden, welche die Probenlösung und Standardlösung sequenziell in die Injektionsschleife aufziehen und dort sogar mischen können.

In der Praxis wird mit dem Agilent-Autosampler (1290 Infinity) zuerst aus einem AS-Vial mit der Lösung des markierten IStd ein bestimmtes Volumen (z.B. 20 µl als die Hälfte des max. Injektionsvolumens) in die Probenschleife zurückgezogen (grün in Bild 1). Das Schema in Bild 1 zeigt, wie die Nadel des AS anschließend auch den Probenanteil (rot) aufzieht (ebenfalls 20 µl). Durch Hin- und Herbewegung des Kolbens der Messvorrichtung könnten Probe und IStd auch noch vermischt werden. Um Verschleppungen zu verhindern, wird mit der Autosampler-Nadel immer zuerst in das Vial mit den markierten Standards gestochen und erst dann in die jeweilige Probenlösung. Vor der Probenaufgabe wird die Nadelaußenseite in einem sog. ¿Flush port¿ (Bild 2) noch einige Zeit durch umströmendes Lösungsmittel gut gereinigt.

Bei der Probenaufgabe und während der anschließenden chromatographischen Trennung wird die Nadel durch den Eluentenstrom permanent von innen durchspült (sog. ¿flow-through¿ Design), so dass Verschleppungen verhindert werden (¿carry over¿ typisch <0,004 %). Nach Entfernung des Proben-Vials in Bild 1 senkt sich die AS-Nadel auf den Injektions-Port und dichtet den Durchflussweg ab. Gleichzeitig schaltet das 6-Wege-Ventil auf die Injektions-Position um und ermöglicht den Durchfluss des LC-Eluenten über die Messvorrichtung und über die Probenschleife zur Trennsäule (Bild 2). So wird die Probe gemeinsam mit dem gelabelten IStd aus der Probenschleife durch die AS-Nadel und über das Ventil zur Trennsäule gespült (gemeinsame Probenaufgabe).

Die Richtigkeit und Präzision der Mischung in der Loop des AS wurden folgendermaßen überprüft: 17 Mykotoxine wurden so in zwei Lösungen aufgeteilt, dass von jeder chem. Klasse (Aflatoxine, Trichothecene, etc.) jeweils ca. die eine Hälfte in Lösung A und die andere in Lösung B vorhanden war. Eine exakt mittels Pipetten präparierte 1:1-Mischung von A und B diente als Kalibrierstandard (Sollwerte). Genau 40 µl daraus wurden fünfmal am Anfang und fünfmal am Ende der Sequenz injiziert und die Mittelwerte der Flächenwerte jedes Zielanalyten mit 100 % gleichgesetzt. Dazwischen wurden jeweils 20 µl der Lösung A und B im AS vereinigt und gemeinsam injiziert. Zuerst wurde die Lösung A zwölfmal als ¿Quasi-Interner Standard¿ mit B als Probe zusammengemischt, danach ebenfalls zwölfmal in umgekehrter Reihenfolge. Diese Umkehrung sollte eventuell Trends (¿Bevorzugung¿) durch die Abfolge aufzeigen. Ein solcher Trend war nicht erkennbar. Letztlich wurde zehnmal mit jeweils 40 µl der 1:1-Mischung kalibriert und die 24 Autosampler-Mischungen (20 + 20 µl) damit ausgewertet. Die Ergebnisse in der Tabelle zeigen eine gute Richtigkeit (durchschnittlich 101 %) der maschinellen Mischung (Fumonisin B2 konnte wegen Interferenzen nicht ausgewertet werden). Die durchschnittliche Standardabweichung der AS-Mischungen war sogar etwas geringer als jene der reinen Kalibrierstandard-Injektionen. Die Präzision wurde in diesem Versuch nicht vom Mischvorgang im Auto-sampler bestimmt, sondern primär von der LC/MS-MS-Messung dominiert. Negative Auswirkungen auf die Peakform konnten bei einer Flussrate von 1 ml/min selbst bei Verzicht auf den Mischvorgang nicht beobachtet werden (Bild 3).

Ein kürzlich von der BAM (Bundesanstalt für Materialforschung und -prüfung, Berlin) durchgeführter Ringversuch ¿T-2 und HT-2 Toxin in Haferflocken¿ war die erste Gelegenheit, diese rasche und kostengünstige Multimethode zu prüfen. Mit Z-Score-Ergebnissen von -0,134 bzw. +0,10 für T-2- bzw. HT-2-Toxin wurde neben der ¿online-SIVA¿ auch die Gesamtmethode für diese hochtoxischen A-Trichothecene bestätigt.


Fazit

Diese verblüffend einfache und vollautomatische Technik bietet sich mit ¿Dilute & Shoot¿ ideal für Multimethoden an, denn die MS-MS-Technik ist optimal für Mehrkomponentenanalysen geeignet.

Immer dann, wenn kein gemeinsames Clean up möglich ist (wegen sehr unterschiedliche Zielanalyten), sollte der hier beschriebene ¿Dilute & Shoot¿¿Ansatz in Erwägung gezogen werden. Das entfallene Clean up schränkt das Analytenspektrum nicht ein und die Dosierung mit einem Gemisch aus mehreren markierten Standards ist angesichts der geringen Einzelkosten gut vertretbar.

Die enorme Kostenreduktion durch die automatisierte Zumischung des Minimal-anteils an isotopenmarkierten Standards direkt im Autosampler ermöglicht nun die Realisierung von Multimethoden mit möglichst vielen internen Standards. Vorraussetzung ist die kommerzielle Verfügbarkeit von gelabelten Standards.

Unter Verwendung von voll 13C-markierten Mykotoxinen konnte mit umfangreichen Validierungen, Ringversuchen und zertifizierten Matrix-Referenzmaterialien die Tauglichkeit dieser Multi-Mykotoxinmethode belegt werden (¿Fit for Purpose¿).


Literatur

  1. Sulyok M., Berthiller F., Krska R., Schuhmacher R., ¿Development and validation of a liquid chromatography/tandem mass spectrometric method for the determination of 39 mycotoxins in wheat and maize¿, Rapid Commun. Mass Spectrom. 20, 2649-2659, 2006.
  2. W. Brodacz, ¿Was tun gegen Matrixeffekte? Teil 1 - Die Achillesferse der LC/MS¿. Chemiereport.at 1/2011; S 46-47 ; Jänner 2011.
  3. W. Brodacz, ¿Was tun gegen Matrixeffekte? Teil 2 - Die Achillesferse der LC/MS¿. Chemiereport.at 2/2011; S 46-47 ; März 2011.
  4. W. Brodacz, ¿Zur Maximierung des Injektionsvolumens in der LC ¿ was ist zu tun¿? Chemiereport.at 2/2012; S. 53-55, März 2012.

Wolfgang Brodacz*)


  1. AGES Österreichische Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit, Lebensmittelsicherheit ¿ Kontaminantenanalytik, Linz, E-Mail: wolfgang.brodacz@ages.at
Anzeige

Das könnte Sie auch interessieren

Anzeige

Chromatographie

Der HPLC-Experte

Dieses Fachbuch wurde von Praktikern für Praktiker geschrieben und will der rasanten Entwicklung auf dem Gebiet der HPLC Rechnung tragen. Der Inhalt deckt Themen von der Gradientenoptimierung über Kopplungs- und 2D-Techniken bis hin zu Tipps für...

mehr...
Anzeige

Schnellster Feuchtebestimmer am Markt für Feuchte-/Feststoffgehalt

Der Feuchtebestimmer SMART 6 analysiert den Feuchtegehalt jeder Probe in nur 2 min. Ob nass oder trocken, Feststoff, Pulver oder Suspension – egal! Alle Probenarten werden dank der Kombination Mikrowelle/Halogen schnell und präzise bis zur Gewichtskonstanz getrocknet. Dank der Temperaturkontrolle sind die Messwerte vergleichbar zu den Standardmethoden.

mehr...

Mikroplatten-Pipette

Manuell, aber mit Servomotor

Die Viaflo 96/384 Mikroplatten-Pipetten wurden für  Anwendungen  wie ELISA, PCR, Nukleinsäure- und Proteinextraktion entwickelt und optimiert. Mit ihrer intuitiven manuellen Bedienung erlauben diese Systeme die Übertragung ganzer Platten in einem...

mehr...
Anzeige

Einweg-Mahlbecher

Arzneimittel ICH Q3D-konform prüfen

Ab Dezember 2017 muss die ICH Q3D „Guideline for Elemental Impurities“ für bereits auf dem Markt befindliche Arzneimittel umgesetzt und die Überwachung der Schwermetallbelastung auf eine spezifische quantitative Kontrolle umgestellt werden.

mehr...

Transfektionsreagenz

Gen-Silencing

Fuse-It-siRNA ist ein Transfektionsreagenz für schnelles und effizientes Gen-Silencing. Auch in sensitiven und schwierig zu transfizierenden Zellen, wie z.B. primären Keratinozyten, beweist es hohe Biokompatibilität.

mehr...
Anzeige

Schnelle automatisierte Lösemittel Extraktion

Das EDGE Extraktionssystem ist ein sequentielles System für die schnelle automatisierte Lösemittel-Extraktion. Damit werden unterschiedliche Proben schnell in nur 5 min. extrahiert. Die Extraktionen im EDGE werden unter Druck und bei erhöhten Temperaturen durchgeführt, was zu einer starken Beschleunigung der Reaktionskinetik führt.

Zum Highlight der Woche...

Killerzellen

Medium für die Kultivierung

Mit dem neuen NK MACS® Medium ermöglicht Miltenyi Biotec die spezifische Kultivierung von menschlichen natürlichen Killerzellen, den sogenannten NK-Zellen. Mit diesem Zellkulturmedium kann der Anwender von voll funktionsfähigen Zellen profitieren,...

mehr...