Mikrotiterplatte als Kultivierungsplattform

Protein-Produktion im Mikromaßstab

In der biotechnologischen Prozessentwicklung zur Herstellung neuer Proteine ist es nötig, aus einer großen Anzahl generierter Klone (oft mehrere 100...1000) die Top-Produzenten herauszufiltern. Daraus ergibt sich die Notwendigkeit, möglichst viele Kandidaten in kurzer Zeit zu durchmustern. Hierbei bietet sich die Mikrotiterplatte als Kultivierungsplattform an, denn diese bietet auf kleinen standardisierten Abmessungen eine große Anzahl Kavitäten (Wells) als parallele Anordnung von Bioreaktoren.

Da nicht allein die genetische Varianz der jeweiligen Klone für die Produktivität ausschlaggebend ist, sondern die Kombination dieser mit der Prozessführung während der Kultivierung, potenziert sich die Zahl der zu absolvierenden Experimente. In der Biotechnologie weit verbreitete Produktionsorganismen wie Escherichia coli, Bacillus subtilis oder Pichia pastoris zeichnen sich u.a. durch schnelles Wachstum und eine hohe Syntheserate von rekombinanten Proteinen aus.

Aufgrund der hohen metabolischen Aktivität ist der Bedarf an Sauerstoff groß. Ein ausreichender Sauerstoffeintrag ins Nährmedium muss daher stets gewährleistet sein.

Der Sauerstoffeintrag ist während der Kultivierung im Produktionsmaßstab (bis zu mehrere 100 Liter und darüber hinaus) oft ein kritischer verfahrenstechnischer Parameter, der genau überwacht und geregelt werden muss. In einem Forschungsprojekt am Lehrstuhl für Bioverfahrenstechnik der RWTH Aachen wurde die Blumengeometrie aus über 30 verschiedenen (beispielsweise Rechteckgeometrie, Polygonen, Sternen, etc.) ausgewählt, da diese alle gestellten Anforderungen erfüllte:

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  • Hoher Sauerstoffeintrag
  • Hohes Füllvolumen
  • Keine Schaumbildung
  • Reduktion der Tröpfen- und Spitzerbildung des flüssigen Wellinhalts
  • Kontinuierliche Bedeckung des Bodens zum Auslesen der Fermentationsbrühe mit der BioLector®-Technologie

Bei der BioLector®-Technologie handelt es sich um ein Hochdurchsatz-Fermentationssystem basierend auf Mikrotiterplatten mit integrierter Online-Sensorik. Mit der Entwicklung der FlowerPlate® wurde die Synthese vollzogen zwischen voll instrumentierten Fermentern und der automatisierbaren Hochdurchsatzkultivierung. Die FlowerPlate® verfügt über einen transparenten Boden, welcher die nicht-invasive Messung von wichtigen Parametern der Fermentationsbrühe ermöglicht.

Die BioLector®-Technologie sorgt für die automatische Quantifizierung von Biomasse, Fluoreszenzproteinen (z.B. GFP, dsRed), intrazellulären Metaboliten (z.B. NAD(P)H, Riboflavin), pH-Wert und Gelöstsauerstoffkonzentration im Minutentakt über die gesamte Zeit der bis zu 48-fach parallel ablaufenden Kultivierungen in einer FlowerPlate®. Die Erfassung von pH-Wert und Gelöstsauerstoffkonzentration erfolgt über am transparenten Boden immobilisierte optische Sensoren (Optoden), welche ebenfalls mit der BioLector®-Technologie ausgelesen werden können.

Die spezielle Blumengeometrie der einzelnen Wells ermöglicht einen Sauerstoffeintrag (OTR > 100 mmol/l/h bzw. kLa > 600 h-1), welcher auch in gerührten Bioreaktoren in der klassischen Bioprozessentwicklung erzielt wird. Die Einhaltung dieser Parameter über den Mikroliter- (FlowerPlate®) bis zum mehreren Liter-Maßstab (gerührter Fermenter) sichert die Übertragbarkeit und damit Relevanz der durchgeführten Experimente.

Fazit:

Die Möglichkeit zur Kultivierung von mikrobiellen Zellen unter hohem Sauerstoffeintrag und damit produktionsrelevanten Bedingungen ist als das wichtigste Merkmal der FlowerPlate® hervorzuheben. Da die zeitlich hoch aufgelöste, automatisierte Erfassung aller Parameter ohne Unterbrechung des Schüttelvorgangs stattfindet, ist der notwendige hohe Sauerstoffeintrag durchgehend gewährleistet. Mit der FlowerPlate®, welche speziell hinsichtlich der Bedürfnisse in der Bioprozesstechnik entwickelt wurde, hält der Forscher buchstäblich eine Mehrzahl an instrumentierten Bioreaktoren in einer Hand. Mit den so gegebenen neuen Möglichkeiten ist es jetzt möglich, die Entwicklung biotechnologischer Verfahren zu miniaturisieren und zu beschleunigen.

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