Fischartenbestimmung mit MALDI-TOF-MS

Schnelle, zuverlässige Identifikation über artspezifische Proteinmuster

Der Vertausch von Speisefisch stellt eine gegenwärtige Form des Betrugs dar, die mit schnellen Analysenmethoden kontrolliert werden kann. Die bei Mikroorganismen bereits etablierte Identifikation über ein artspezifisches Proteinmuster mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie wird seit Kurzem im Intertek-Labor in Bremen auf Speisefisch angewandt. Eine Datenbank von Proteinspektren bekannter Speisefische wurde aufgebaut und erfolgreich validiert.

Selbst einem Laien der Speisefisch-Szene wäre der morphologische Unterschied zwischen einer Seezunge und einem Pangasius klar ersichtlich, wenn beide Arten denn in der Komplexität ihres natürlichen Erscheinungsbildes vor ihm liegen würden. Doch wechselt Speisefisch oft nur noch als anonymisiertes Filet die Ladentheke. Und das weniger diverse Erscheinungsbild eines Fischfilets bietet die durchaus genutzte Möglichkeit, Fisch unter falschem Namen zu verkaufen. Der Verkauf günstigen Fisches unter ‚teurem Namen‘ bietet einen finanziellen Vorteil auf Kosten der Fischindustrie und gefährdet das Vertrauen des Verbrauchers in das Produkt Fisch. Die Spezieskontrolle stellt folglich eine Möglichkeit dar, aufgekaufte Ware im Zwischenhandel zu testen. Eventuellen Betrügern kann durch regelmäßige Stichproben die Schaffensfreiheit genommen werden.

Gegenwärtige Produktkontrolle
Zur zuverlässigen taxonomischen Einordnung einer Art ist das Amplifizieren mittels Polymerase-Kettenreaktion und Sequenzieren eines spezifischen DNA-Abschnittes derzeit die etablierte Methode. Dieser Arbeitsablauf bedarf allerdings eines gewissen Zeitaufwandes, der bei einem verderblichen Produkt wie Fisch möglichst reduziert sein sollte. Beschleunigt werden kann die Identifikation durch Real-time-PCR-(RT-PCR-)Anwendungen, wenn geeignete Kits für Fischarten von Interesse vorhanden sind. Dies ist für diverse Arten derzeit jedoch nicht der Fall. Zusätzlich sollte die zu erwartende Spezies der Probe bekannt sein. Denn eine Non-targeted-Analyse ist bei der RT-PCR nicht möglich.

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Artbestimmung über Proteinmuster
Eine jüngere Methode der Artbestimmung hat in den vergangenen Jahren bei der Identifikation von Mikroorganismen wie Bakterien, Schimmelpilzen und Hefen Einzug gehalten und weite Anwendung besonders im klinischen Sektor gefunden. Die Identifikation erfolgt hierbei über die Detektion eines Proteinmusters, das artspezifisch und somit individuell ist. Von diesem Proteinmuster wird mittels Massenspektrometrie (MS) ein Spektrum im Bereich von etwa 2–20 kDa aufgenommen.

Bild 1: Probenaufarbeitung

Als Methode findet die matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight-(MALDI-TOF-)MS Anwendung. Die Vorteile der Methode finden sich in niedrigen Betriebskosten und der schnellen Generierung verlässlicher Ergebnisse. Die Aufarbeitung ist im Vergleich zur RT-PCR oder Sequenzierung als sehr simpel zu bezeichnen, da lediglich reine Bakterienbiomasse einer kultivierten Probe auf ein Edelstahl-Target aufgetragen wird. Die Biomasse wird mit einer organischen Säure (Matrix), bei gegenwärtiger Anwendung mit einem Zimtsäurederivat, überschichtet. Im MS führt die Belaserung der Proben-‚Spots‘ zu einer einfachen Protonierung von Proteinen (Ionisierung) und Herauslösen dieser aus dem kristallinen Verbund (Desorption). Im Vakuum des Flugrohres werden die geladenen Proteine aufgrund der unterschiedlichen massenbedingten Fluggeschwindigkeit getrennt (time of flight), detektiert und das Massenspektrum erstellt. Eine Identifikation kann auch non-targeted, also ohne einen Vorverdacht auf die Spezies, durchgeführt werden. Als Voraussetzung für die Anwendung muss eine Datenbank an definierten Proteinspektren vorliegen, gegen die das Spektrum der unbekannten Probe abgeglichen wird.

Artidentifizierung bei höheren Organismen
Das ‚proof of principle‘ der Artidentifizierung bei höheren Organismen ist durch diverse wissenschaftliche Studien an Spinnentieren, Insekten und auch marinen Organismen bereits dargelegt worden. Für Säugetiere befinden sich Datenbanken derzeit in stetem Aufbau. Eine Routineanwendung an höheren Organismen hat diese Methodik allerdings noch nicht erreicht.

Ein hochentwickelter Eukaryot führt die Methode im Vergleich zu einem einzelligen Bakterium vor zusätzliche Herausforderungen. Denn während sich bei einem Bakterium die Gesamtheit des Proteoms in einer Zelle befindet, verfügt ein Fisch über differenziertes Gewebe, welches entsprechend der Gewebefunktion über ein divers exprimiertes Proteom verfügt. Bei dem Anwenderziel, die Datenbank für die Routineüberprüfung von Speisefisch einzusetzen, wird ausschließlich das Muskelfleisch bzw. Filet fokussiert. Außerdem kann Fisch bei Ankunft im Labor schon einige Tage tot sein – ein Faktor, der bei der Bakterienidentifikation praktisch nicht zum Tragen kommt. Postmortale Veränderungen des Proteoms sind bei der Analyse von Fisch also zu beachten.

Bild 2: Dendrogramm ausgewählter Fischarten. Jede Art wird durch mindestens drei Individuen repräsentiert, jedes Individuum durch nochmals zwei generierte Einträge.

Erstellung einer Fischdatenbank
Mit der Datenbank wird das Ziel verfolgt, gehandelten Speisefisch auf die Richtigkeit der ausgezeichneten Art zu testen. Dementsprechend wurde zunächst eine Liste an favorisierten Fischen auf Basis einer Literaturrecherche erstellt. Ein Fokus wurde hierbei auf Arten gelegt, welche bereits als vertauscht beschrieben wurden. Als Beispiel ist hier die die Ordnung der Plattfische (Pleuronectiformes) zu nennen, zu denen auch die eingangs genannte Seezunge zählt.

In Vorversuchen wurde ein optimiertes Aufarbeitungsprotokoll erstellt (Bild 1). Die benötigte Zeit von Beginn der Aufarbeitung bis zum Ergebnis beträgt weniger als zwei Stunden. Aufgrund einer Kooperation mit einem namhaften Lebensmittelproduzenten konnte ein Großteil der derzeit in der Datenbank hinterlegten Fischarten bezogen werden. Eine Sequenzierung des Cytochrom-c-Oxidase-I-Gens fand zusätzlich statt, um die Richtigkeit aller Datenbankeinträge abzusichern.

Die Erstellung der Einträge erfolgte mit der Bruker Biotyper-3-Software, welche eine Anwendung zur autarken Erstellung von Datenbanken bietet. Der derzeitige Stand beläuft sich auf 38 offiziell eingetragene Fischarten, unter denen sich klassische Vertreter wie Seelachs (Pollachius virens), Rotbarsch (Sebastes norvegicus) und Regenbogenforelle (Oncorhynchus mykiss) befinden. Aber auch exotischere Varianten wie Zackenbarsch (Epinephelus marginatus) und Bonito (Sarda sp.) sind vertreten. Etwa 20 weitere Arten befinden sich derzeit in der Pipeline für eine Datenbankerweiterung. Zusätzlich wurden über 100 kommerziell erworbene Fischfilets zur Validierung herangezogen.

Bild 3: Spektrenabgleich einer Kabeljau-Art (Gadus chalcogrammus) gegen weitere Arten der Gattung Gadus.

Abgeglichene Probenspektren werden, der Bakterienidentifizierung angelehnt, mit einem Ergebnis-Score bewertet, welcher eine Aussage über die Ähnlichkeit der Probenspektren und Verlässlichkeit der Identifikation liefert. Empfehlungen zu Qualitätsparametern der Einträge sind seitens des Geräteherstellers formuliert und unsererseits angewendet worden (z.B. geforderte Signalintensität oder Mindestanzahl an Einzelspektren pro Eintrag). Um eine innerartliche Diversität zu repräsentieren, wurden pro Art mindestens drei Individuen herangezogen. Von jedem Individuum wurden außerdem zwei Datenbankeinträge erstellt (Bild 2).

In Versuchsreihen lagerten wir Fischfilet über mehrere Tage bei 4 °C. Es zeigte sich, dass sich das Proteinspektrum nach sieben Tagen Lagerung so weit veränderte, dass eine sichere Artbestimmung möglich ist, aber gemindert sein kann. Dieses Resultat ist bei Anwendung der Methode zu berücksichtigen. Es stellt im Hinblick auf den Anwendungsbereich der Analyse aber kein Hindernis dar, da die zu analysierenden Proben auf frischen, für den baldigen Verzehr vorgesehenen Fisch abzielen, der oftmals auf Eis gelagert ist.

Eine noch problemlosere Variante ist gefrorener Fisch, wie er häufig im Tiefkühlfach von Supermärkten vorzufinden ist: Unsere Vorabtests zeigten, dass bei -18 °C aufbewahrte Filets auch nach sechs Monaten Lagerung noch sicher identifizierbar waren.

Resolution Power
Die geringen innerartlichen, aber hohe zwischenartlichen Differenzen der Proteinspektren ermöglichen eine klare Artidentifizierung (Bild 2). Interessant wird die Fragestellung, inwieweit die Methode in der Lage ist, auch nahe verwandte Fischarten, welche sich in ihrem Proteinmuster nur geringfügig unterscheiden, differenzieren zu können. Der verwechselnd hohe Ergebnis-Score im Abgleich gegen den Datenbankeintrag eines nahen Verwandten ist in Bild 3 am Beispiel verschiedener Kabeljau-Arten demonstriert. Ein Score >2,300 wird im Bereich der Bakterienanalyse als verlässliche Artidentifikation eingeordnet (neuere Erkenntnisse setzen diesen Grenzwert noch tiefer an). Eine Probe Alaska-Seelachs (Gadus chalcogrammus) liefert im Abgleich gegen die eigene Art einen Score von 2,615. Der explizite Abgleich mit zwei weiteren Arten der Gattung, dem Pazifischen (G. macrocephalus) und dem Atlantischen Kabeljau (G. morhua) liefert ebenfalls Werte, die über 2,3 liegen (2,464 und 2,306). Solche Ergebnisse können dann problematisch werden, wenn nicht die „wahre“ Art der Probe von der Datenbank erfasst ist, sondern nur ein naher Verwandter, mit dessen Abgleich ein ebenfalls hoher Score ermittelt wird. Folglich würde am gezeigten Beispiel eine Probe G. chalcogrammus fälschlich als G. macrocephalus identifiziert werden.

Als Resümee dieser Feststellung bedarf die Datenbank wohl definierter Einschränkungen bei der Ergebnisausgabe. Das betrifft besonders Fälle, bei denen ein naher Verwandter noch nicht erfasst ist und man experimentell die Spektrendifferenz nicht ermitteln kann. Im Falle des genannten Beispiels müssen bei Kenntnis über einen fehlenden nahen Verwandten Einschränkungen in der Ergebnisausgabe definiert werden. Ist bekannt, dass die Art G. chalcogrammus nicht in der Datenbank vertreten und somit als Ergebnis nicht auszuschließen ist, darf eine Ergebnisausgabe nicht auf Artebene, sondern etwa nur auf Gattungsebene erfolgen (Gadus sp. anstelle von Gadus macrocephalus). Entsprechend wurden alle Einträge auf das Vorhandensein und Fehlen nahe verwandter Arten geprüft und ggf. Einschränkungen der beschriebenen Herangehensweise definiert. Als Maß für eine nahe Verwandtschaft wurde die Sequenz-Ähnlichkeit des Cytochrom-c-Oxidase-I-Gens herangezogen.

Fazit
Die Fischartenidentifizierung mittels MALDI-TOF-MS bedarf der Beachtung einiger Parameter. Sie ist zuverlässig auf frisches oder gefrorenes, verzehrtaugliches Filet anzuwenden. Nicht für alle Einträge der Datenbank ist derzeit eine Ergebnisausgabe auf Artebene möglich. Dies stufen wir als nicht einschränkend für den Anwendungsbereich der Analyse ein, da Vertausch von Speisefisch zur finanziellen Bevorteilung in der Regel grob ist und sich nicht auf Ebenen innerhalb der Gattung abspielt.

Das hier vorgestellte Verfahren ist im Jahr 2017 durch die Deutsche Akkreditierungsstelle GmbH (DAkkS) erfolgreich in unserem Labor akkreditiert worden.

Literatur
Stahl A & Schröder S (2017) Development of a MALDI TOF MS-Based Protein Fingerprint Database of Common Food Fish Allowing Fast and Reliable Identification of Fraud and Substitution. J. Agric. Food Chem. 65 (34): 7519–7527.
Rau J, Eisenberg T, Wind C, Lasch P & Sting R (2016) MALDI-UP – An Internet Platform for the Exchange of MALDI-TOF Mass Spectra. Asp. Food Control Anim. Heal. 1: 1-17.Pardo MÁ, Jiménez E & Pérez-Villareal B (2016) Misdescription Incidents in Seafood Sector. Food Control 62: 277-283.

AUTOREN
Dr. Antje Stahl
Intertek Food Services GmbH, Bremen
E-Mail: antje.stahl@intertek.com

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