Speiseölanalytik

Eine für alle: Speiseölanalytik mit NMR-Spektroskopie

Öle und Fette spielen in der Lebensmittelindustrie eine bedeutende Rolle. Qualitätskontrolle und Qualitätssicherungsmaßnahmen dienen dazu, einen gleichbleibend hohen Standard der Lebensmittel zu gewährleisten. Hierzu veröffentlichten die Deutsche Gesellschaft für Fettwissenschaft (DGF) sowie die American Oil Chemists‘ Society (AOCS) zahlreiche offizielle Ein- heitsmethoden zur Analyse von Fetten und Ölen. 

NMR-Spektroskopie zur Untersuchung der Produktqualität, Identifizierung von Authentizität, Verfälschungen und Falschkennzeichnungen von Speiseölen und Fetten. (Bild: Spectral Service)

Primär kommen bei der Speiseölanalytik Techniken der Titration, Gaschromatographie (GC) und Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) zur Anwendung. Die klassischen Qualitätsparameter Iod-, Säure-, Verseifungs- und Peroxidzahl werden mit Titrationstechniken bestimmt, während die Komposition der Fettsäuren und Sterole mit der GC untersucht werden. Die Charakterisierung der Phospholipide, Mono- und Diglyceride erfolgt mit der HPLC [1,2].

Für eine vollständige chemische Beurteilung einer Ölprobe werden in Summe bis zu zehn verschiedene analytische Methoden eingesetzt, mit der Folge eines hohen Zeitaufwands sowie hohen Kosten (Tabelle 1). Eine Technik, mit der alle klassischen Ölparameter in nur einer Analyse bestimmt werden, ist die Protonen-Kernresonanzspektroskopie (engl. proton nuclear magnetic resonance, 1H-NMR), die die herkömmlichen Analysenmethoden vollständig ersetzen kann (Bild 1, Tabelle 1) [3,4,5]. Im Gegensatz zu herkömmlichen Untersuchungen werden für eine NMR-Analyse nur 200 mg anstatt mehreren Gramm Öl als Probenmaterial eingesetzt. Die Verwendung von Referenzsubstanzen oder internen Standards ist hierbei nicht erforderlich.

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Lipide
Pflanzenöle bestehen aus über 90 % Triacylglyceriden (TAG). TAG sind dreifache Ester des Glycerins mit drei Fettsäureketten (Bild 2). Fettsäuren unterscheiden sich durch die Anzahl der C-Atome (Kettenlänge) sowie bei ungesättigten Fettsäuren in der Anzahl und Position von Doppelbindungen. Zu den wesentlichen Fettsäuren in Speiseölen gehören die gesättigte Myristinsäure (C14:0), Palmitinsäure (C16:0), Stearinsäure (C18:0) sowie die ungesättigte Ölsäure (C18:1), Linolsäure (C18:2) und Linolensäure (C18:3). Die Komposition der Fettsäuren ist charakteristisch für die Ölpflanze und wird zur Feststellung von Reinheit und Verfälschungen hochwertiger Öle verwendet.

Bild 1: 1H-NMR-Spektrum einer Pflanzenölanalyse mit ausgewählten, spezifischen NMR-Signalen.

Peroxide und Aldehyde
Die Lipid-Oxidation ist die primäre Ursache der Verschlechterung der Ölqualität und der Nährwerte sowie der Verringerung der Haltbarkeit. Im Rahmen des Autoxidationsprozesses entstehen Peroxide als primäre Oxidationsprodukte, die zu den sekundären Produkten wie Aldehyden, Ketonen, Alkoholen und Säuren reagieren. Peroxide werden in der herkömmlichen Lipidanalytik unter dem Qualitätsparameter Peroxidzahl (engl. Peroxide Value, PV) erfasst. Die Peroxidzahl bestimmt das Maß für den Gehalt an peroxi-disch gebundenem Sauerstoff eines Fettes oder Öles, insbesondere an Hydroperoxiden, und dient der Beurteilung des Oxidationsgrades. Jedoch werden in der iodometrischen Titration spezifische Fettbestandteile wie Thymochinon im Schwarzkümmel oder Hydroxytyrosol im Olivenöl mit erfasst und verfälschen somit die Peroxidresultate.

Im Gegensatz zur klassischen Titration der Peroxidzahl kann im 1H-NMR-Spektrum selektiv zwischen individuellen Peroxiden und Fettbegleitstoffen unterschieden werden [4]. Mit der NMR-Spektroskopie können Peroxidzahlen ab 0,1 meq/kg qualitativ und ab 0,2 meq/kg quantitativ bestimmt werden.

Bild 2: Allgemeine Struktur der Triacylglyceride. Die Seitenketten R1, R2, R3 stehen für die gesättigten und ungesättigten Alkylreste der Fettsäuren.

Ein sensorischer Qualitätsverlust tritt dann ein, wenn sekundäre, flüchtige Verbindungen wie Aldehyde entstehen, die unter dem Qualitätsparameter Anisidinzahl (engl. Anisidine Value, AV) bekannt sind. Bereits bei geringen Konzentrationen beeinflussen diese Geruch und Geschmack negativ. Linolensäurehaltige Öle verderben wegen der hohen Reaktionsfähigkeit der dreifach ungesättigten Fettsäuren sehr schnell und schmecken schon bei geringen Aldehydkonzentrationen ranzig. Mit der NMR-Spektroskopie können einzelne Aldehyde wie z.B. Hexanal, Hexenal und Hexadienal qualitativ und quantitativ bestimmt werden. Eine Umrechnung der NMR- auf die UV/Vis-Werte ist nicht unproblematisch, da einzelne Aldehyde unterschiedlich hohe UV/Vis-Absorptionskoeffizienten bei λ = 350 nm aufweisen. Somit ist die Anisidinzahl nicht nur konzentrations-, sondern auch substanzabhängig [7]. Mit der NMR-Spektroskopie erfolgt hingegen eine molare, substanzunabhängige Bestimmung der individuellen Aldehyde. 

Iodzahl (Iodine Value, IV)
Die Quantifizierung der Doppelbindungen ermöglicht die Bestimmung des molaren Anteils an ungesättigten Fettsäuren im Öl, der auch unter dem Qualitätsparameter Iodzahl bekannt ist. Die Iodzahl wird mittels der Titration bestimmt, wobei der Analyt nicht direkt titriert wird. Bei der Iodometrie handelt es sich um eine indirekte Titration, deren Problematik in der geringen Selektivität liegt. Eine Differenzierung zwischen Doppelbindungen von Fettsäuren und Fettbegleitstoffen ist unmöglich – eine Herausforderung, die mit der NMR-Spektroskopie bewältigt werden kann. Die Quantifizierung der Doppelbindungen im 1H-NMR-Spektrum kann direkt in die Iodzahl umgerechnet werden.

Säurezahl (Free Fatty Acids, FFA)
Durch enzymatische, mikrobielle, chemische oder autooxidative Spaltungen von TAG entstehen freie Fettsäuren, die als Säurezahl bestimmt werden.

Bild 3: Vergleich der Fettsäuren von Erdnuss-, Haselnuss-, Kürbiskern-, Lein-, Leindotter-, Mandel-, Oliven-, Raps-, Sonnenblumen-, Walnussöl.

Freie Fettsäuren führen zu einem schnellen Verderb des Öls und weisen bei kurzkettigen freien Fettsäuren einen ranzigen oder seifigen Geschmack auf, der nicht nur die Produktqualität vermindert, sondern auch zu Problemen in der Fettweiterverarbeitung führt. Freie Fettsäuren können mit der NMR-Spektroskopie ab einer Konzentration von 0,1 % direkt quantitativ bestimmt werden [6].

Phytosterole
Phytosterole sind pflanzliche Zellmembrankomponenten, die besonders reich in Sonnenblumensamen, Sojabohnen und Kürbiskernen enthalten sind. β-Sitosterol ist mit ca. 65  % das am häufigsten vorkommende Phytosterol in Nahrungsmitteln, gefolgt von Campesterol und Stigmasterol [8]. Das 1H-NMR-Spektrum gibt Auskunft über den gesamten Sterolgehalt, da die Signale des Sitosterols und Campesterols nicht vollständig basisliniengetrennt sind. Für eine quantitative Aussage individueller Sterole wird ein entsprechendes Kohlenstoff-Spektrum (13C-NMR-Spektrum) verwendet [6].

Bild 4: 13C-NMR-Spektrum eines Öls mit Zuordnung der Fettsäuren in sn-Positionen.

Fettsäureverteilung
Das Fettsäureprofil von Lipiden kann mittels 1H-NMR analysiert werden (Bild 3). Hierbei erfolgt die Bestimmung der gesamten gesättigten sowie individueller ungesättigter Fettsäuren C18:1, C18:2, C18:3 und ω-3. Die Komposition der Fettsäuren ist Ölsorten-spezifisch und kann zur Authentizitätsprüfung eingesetzt werden.

In Folge der heutzutage schwer detektierbaren Verfälschungen werden geeignete Methoden mit höherer Sensitivität und Selektivität benötigt. Die NMR-Spektroskopie stellt eine leistungsstarke Analysenmethode dafür dar. Ein vollständiges Bild der komplexen Fettsäurezusammensetzung liefert die 13C-NMR-Spektroskopie. In der Carbonylregion des 13C-NMR-Spektrums wird die Position der Fettsäure am Glycerinrest bestimmt. Bild 4 zeigt, dass sich die gesättigten Fettsäuren (sat.) nur am äußeren Rand des Glycerins, in der sn1/3- Position befinden. In der Mitte des Glycerinrests, der sn2-Position, werden primär ungesättigte Fettsäuren verestert.

Tabelle 1: Liste der Parameter für herkömmliche und alternative Lipidanalytik [6].

Fazit
Die NMR-Spektroskopie ist eine leistungsstarke Analysentechnik im Bereich der Lebensmittelkontrolle und kann im Speziellen zur Qualitätsbeurteilung von Ölen eingesetzt werden. Im Gegensatz zu klassischen Fett-analysenmethoden werden alle Qualitätsparameter mit der NMR-Spektroskopie in nur einem Analysendurchgang geprüft, wobei lediglich eine geringe Probenmenge von 200 mg verwendet wird. Die Bestimmung der Parameter ist unabhängig vom Einsatz eines internen Standards oder Referenzmaterialien.

Eine detaillierte Ermittlung der Fettsäurezusammensetzung liefert die 13C-NMR-Spektroskopie. Zahlreiche Forschungen und Veröffentlichungen haben gezeigt, dass die NMR-Spektroskopie eine geeignete Technik zur Untersuchung der Produktqualität, Identifizierung von Authentizität, Verfälschungen und Falschkennzeichnungen von Speiseölen und Fetten darstellt. 

Literatur
[1] A.O.C.S Official Methods CE 1-62, American Oil Chemists‘ Society, IL, USA.

[2] J.D. Craske, C.D. Bannon, „Gas liquid chromatography analysis of the fatty acid composition of fats and oils: A total system for high accuracy”; Journal of the American Oil Chemists‘ Society, 64, S. 1413-1417 (1987).
[3] C. Skiera, P. Steliopoulos, T. Kuballa, U. Holzgrabe, B. W. K. Diehl, „1H NMR approach as an alternative to the classical p-anisidin value method”, European Food Research and Technology, 235, S. 1101-1105 (2012).
[4] C. Skiera, P. Steliopoulos, T. Kuballa, U. Holzgrabe, B. W. K. Diehl, „1H NMR Spectroscopy as a New Tool in the Assessment of the Oxidative State in Edible Oils”, Journal of the American Oil Chemists‘ Society, 89, S. 1383-1391 (2012).
[5] C. Skiera, P. Steliopoulos, T. Kuballa, B. W. K. Diehl, U. Holzgrabe, „Determination of free fatty acids in pharmaceutical lipids by 1H NMR and comparison with the classical acid value”, Journal of Pharmaceutical and Biomedicial Analysis, 93, S. 43-50 (2014).
[6] B. W. K Diehl, C. Skiera, „Nuclear Magnetic Resonance (NMR)-Spektroskopie“. In: Matthäus B, Fiebig H.-J (Hrsg.) Speiseöle und -Fette, Recht, Sensorik, Analytik. Erling, EU, S. 169-201 (2013).
[7] H. Pardun, „Beurteilung des Präoxydationsgrades bzw. der Oxydationsstabilität pflanzlicher Öle aufgrund ihrer Benzidinoder Anisidinzahl“. Fette Seifen Anstrichmittel, 76, S. 521-528 (1974).
[8] D. Haller, T. Grune, G. Rimbach, „Biofunktionalität der Lebensmittelinhaltsstoffe“. Springer, Heidelberg S. 220 (2013).

Elina Zailer
Bernd W. K. Diehl
Spectral Service AG, Köln

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