DualChip-GMO-Kit V2.0

GVO-Nachweis in Futter- und Lebensmitteln

Neues Screening-Verfahren mit dem DualChip® GMO
BBild 1: Schema der Versuchsdurchführung des DualChip® GMO Kits V2.0 und der anschließenden Detektion durch das Silverquant®-System.


Dr. Barbara Schaffrath*)

  1. Eppendorf Biochip Systems GmbH, Barkhausenweg 1, 22339 Hamburg, biochipsystems@eppendorf.de


Ende Juni 2008 fand in Como, Italien, der weltweit erste Kongress statt, der ausschließlich der Detektion von gentechnisch veränderten Organismen (GVO) gewidmet war (http://gmoglobalconference.jrc.it/menu.htm). Das Spektrum der Themen reichte von der Probenentnahme über Extraktionsmethoden von DNA und Proteinen sowie den geeigneten Analysenmethoden bis hin zur Auswertung der erhaltenen Ergebnisse.


Die Detektion von GVO in Saatgut, Lebens- und Futtermitteln ist technisch anspruchsvoll, und diese Konferenz bot den daher notwendigen Austausch auf wissenschaftlicher Basis. Im Unterschied zu vielen anderen wissenschaftlichen Kongressen ziehen die Diskussionen und Ergebnisse dieses Treffens Kreise, die weit über die relevante wissenschaftliche Gemeinschaft hinausgehen, da die Analyse von GVO einen direkten Einfluss auf den Verbraucherschutz und den weltweiten Handel hat. Dazu zählen das Recht des Verbrauchers auf Information und Wahl sowie die Gewährleistung des internationalen Handels. Da in den verschiedenen Ländern die Verwendung und der Anbau von GVO unterschiedlich reguliert ist, ergeben sich für die überprüfenden Instanzen neue Herausforderungen: So verlangt die wachsende Zahl der weltweit existierenden GVO nach komplexeren Analysenmethoden und vergrößert die Anzahl der zu testenden Parameter. Zudem wird der Ruf nach einer weltweiten Standardisierung der Methoden lauter.

Quantifizierung notwendig

Die am weitesten verbreiteten Technologien zur Detektion von GVO sind Protein- und DNA-basierte Methoden. Ansätze zur Detektion unter Verwendung von z.B. Infrarot-Fluoreszenz- oder Massenspektroskopie sind vielversprechend und offerieren Vorteile (z.B. Kosten- und Zeitersparnisse, einfachere Detektion von unbekannten GVO), aber sind noch nicht in einem Maß gereift, das eine Routine-Anwendung erlaubt.

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Viele der bereits etablierten Methoden bieten in bestimmten Anwendungsbereichen (z.B. in Produktionsprozessen, zur Rückverfolgbarkeit oder bei der Überprüfung von Importgütern) eindeutige Vorteile. Herausforderungen hingegen ergeben sich bei der Wahl einer geeigneten Methode, die ein möglichst breites Auswahlprüfverfahren („Screening“) zulässt, was auch die Detektion von nicht-autorisierten oder sogar unbekannten GVO zulässt. So ist derzeit der Goldstandard in den Prüflaboren die PCR. Hierbei werden für GVO spezifische oder in GVO häufig verwendete DNA-Marker detektiert.

Will man ein Screening durchführen, so werden verschiedene Marker in Einzelnachweisen überprüft. Die Kombination der Ergebnisse gibt dann Aufschluss darüber, welche GVO in der Probe vorliegen könnten. Nur die bekannten GVO können über die Detektion spezifischer Marker charakterisiert werden. Da häufig Grenzwerte für die Verwendung von GVO existieren, ist die Quantifizierung der Ergebnisse im Laufe des Prozesses notwendig. Daher sind entweder von Beginn des Screening-Prozesses an oder bei der endgültigen Identifizierung am Ende des Screening-Prozesses quantitative PCR (qPCR) Reaktionen notwendig. Meist handelt es sich hier um relative Quantifizierungen, bei denen die Menge des GVO-Markers in Relation zur Menge an Pflanzen-DNA gesetzt wird. Daraus lassen sich dann prozentuale Angaben für die Menge an GVO in der Probe errechnen.
Möchte man das Screening möglichst breit gestalten, dann ist eine große Anzahl an PCR-Reaktionen notwendig. Meist werden in den Prüflaboren Screening-Abläufe festgelegt, bei denen bestimmte „Sets“ an PCR-Reaktionen zur Identifizierung von verschiedenen GVO-relevanten Markern abgearbeitet werden. Dabei bestimmt das Ergebnis jedes Sets über die weitere Vorgehensweise und Auswahl des nächsten Marker-Sets. Dieses Vorgehen ist gut etabliert und liefert umfassende Ergebnisse. Dennoch bestehen einige Einschränkungen: In den meisten Fällen sind viele parallele Analysenansätze notwendig; durch die Auswahl der zu detektierenden Marker wird die Anzahl der zu detektierenden GVO limitiert und die Auswertung der umfangreichen Ergebnisse kann aufwendig sein. Diese Gründe waren für Eppendorf ausschlaggebend, eine Technologie zu entwickeln, die eine einfache Lösung für die beschriebenen Aufgaben bietet.

Der DualChip® GMO

Daraus resultierte der DualChip® GMO, der Ende Juni dieses Jahres in seiner zweiten Version auf den Markt gebracht wurde. Der DualChip® GMO ist ein neuartiges Screening-Werkzeug zur initialen Detektion von GVO in Saatgut, Futter- und Lebensmitteln. Während die entsprechenden Marker beim DualChip® GMO durch PCR-Reaktionen (insgesamt drei 7- bis 12-plex-Reaktionen) amplifiziert werden, ist der sich anschließende Nachweis Microarray-basiert und ermöglicht somit die parallele Detektion aller untersuchten GMO in einem standardisierten Verfahren.

Generell versteht man unter Microarrays molekulare Werkzeuge, bei denen auf Trägern immobilisierte Moleküle (DNA, RNA, Proteine, Zucker, usw.) ihre Reaktionspartner binden und damit deren Detektion ermöglichen. Der Variabilität bzgl. der verwendeten Träger, der Art und des Grades der Immobilisierung, der Reaktionspartner und der Art des Nachweises sind fast keine Grenzen gesetzt.

Die ursprünglichen Microarray-Anwendungen waren vor allem auf die Erstellung von Genexpressionsprofilen im humanen Forschungsbereich fokussiert. Mittlerweile haben sich vielfältige Applikationen für Microarrays entwickelt. Die Stärke dieser Technologie liegt eindeutig in der Miniaturisierung und Parallelisierung von Tests, so dass viele Parameter innerhalb eines einzigen Assays bestimmt werden können. Genau diese Vorteile hat Eppendorf beim DualChip® GMO genutzt: Mittels eines Microarrays kann eine Probe auf insgesamt 30 verschiedene GVO-Marker und Pflanzenmarker in einem Experiment untersucht werden. Die Visualisierung der detektierten Marker wird durch Eppendorfs proprietäres Silverquant®-System durchgeführt. Prozesskontrollen ermöglichen eine sichere Durchführung des Assays. Eine genaue Beschreibung der Durchführung des Assays ist aus Bild 1 zu ersehen.

Matrix-Ansatz

Neben insgesamt sechs Pflanzenmarkern (Kartoffel, Raps, Mais, Sojabohne, Reis, Zuckerrübe) können 23 GVO-Marker mit dem Microarray-System nachgewiesen werden. Dabei wird zwischen allgemein häufig in GVO verwendeten Markern (wie z.B. Promotoren, Terminatoren oder bestimmten Resistenz-bestimmenden Genen) und spezifischen Markern, die eindeutig einem bestimmten GVO (z.B. Roundup Ready Soy®) zuzuordnen sind, unterschieden. Durch die Kombination dieser Marker, die im Weiteren als Matrix-Ansatz bezeichnet wird, können bestimmte GVO erkannt oder ausgeschlossen werden. Im Gegensatz zu den klassischen PCR-basierten Nachweisverfahren stellt der Matrix-Ansatz (siehe Bild 2) also ein breites Analysenverfahren dar, durch das Proben auf den Gehalt an GVO – sowohl autorisierte als auch nicht-autorisierte – überprüft werden können.

Vervollständigt wird das System durch eine Software, die auf Grund der detektierten Marker automatisch Vorschläge für in der Probe vorhandene GVO liefert und somit die aufwendige Auswertung der klassischen Verfahren ablöst. Damit beschränkt sich der notwendige Aufwand auf eine finale Überprüfung. Bild 3 zeigt ein Beispiel für den ISO17025-konformen Bericht, der am Ende der Auswertung automatisch erstellt wird.

Die Praktikabilität und Verlässlichkeit des Systems wurde 2007 im Rahmen einer multizentrischen Ringstudie überprüft. Die Studie wurde vom Joint-Resarch-Centre (JRC) der Europäischen Union koordiniert und in insgesamt zwölf Laboren aus acht verschiedenen Ländern durchgeführt (http://biotech.jrc.it/home/documents/report-JRC-EAT.pdf). In diesem Rahmen untersuchte jedes der beteiligten Labore 36 Blindproben mit unterschiedlichem Gehalt an Pflanzenmaterial, GVO- und nicht-GVO-Material. Die statistische Auswertung der Experimente belegte eine Sensitivitätsgrenze für alle genetischen Elemente von 0,1 % mit einer Sicherheit von 95 %. Über diese Grenzwerte hinaus handelt es sich bei dem Nachweis mittels des DualChip® GMO um einen qualitativen Assay. Eine nachfolgende quantitative Analyse ist somit auf die im Test detektierten GVO begrenzt, so dass im Gegensatz zu den klassischen Nachweisverfahren hier nur noch die quantitative Analyse eines oder weniger Marker notwendig ist.

Bei einer Vergleichstestung komplexer Proben (bis zu sieben GVO in einer Probe) mit dem DualChip® GMO und einer qPCR-Methode konnte eine sehr hohe Korrelation zwischen den beiden Methoden beschrieben werden, was die hohe Sensitivität und Spezifität des Microarray-basierten Systems belegt (http://gmoglobalconference.jrc.it/2008/Posters/T.2.19%20DualChip%20GMO%20poster180608.pdf).

Fazit

Als Komplettsystem (alle Reagenzien zur Versuchsdurchführung, Microarrays, Analysen-Software, Instrumente zur Durchführung der Hybridisierung und Färbung und Scannersystem) bietet der Screening-Ansatz von Eppendorf zum Nachweis von GVO in diversem Probenmaterial eine robuste, sensitive und kostenattraktive Lösung für Routine- und Forschungslabore. Das Spektrum an abgedeckten Parametern und die komplexe Analysenausrichtung durch den Matrix-Ansatz ermöglichen ein breites Screening für GVO in Saatgut, Futter- und Lebensmitteln. Die Schlussfolgerung der Analyse wird durch die Auswerte-Software und den Ergebnisbericht stark vereinfacht und ermöglicht auch die rasche Analyse komplexer Proben.

Vergleiche zwischen qPCR- und DualChip® GMO Microarray-generierten Ergebnissen bestätigen die hohe Korrelation der beiden Ansätze und bestätigen die komplementäre Positionierung der beiden Methoden. Auch durch die Validierung des Systems durch das JRC bietet der DualChip® GMO somit auf verschiedenen Ebenen einen neuen Standard für alle Fragestellungen, bei denen multiple Parameter einfach, zeit- und kostengünstig bestimmt werden sollen.

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