Isotopenmarkierte interne Standards in der Mykotoxin-Analytik

Surrogates fungieren als „Stellvertreter“ für die Zielanalyten und übernehmen meist auch die Funktion einer Retentionszeit-Referenzsubstanz. Im Gegensatz zu internen Standards werden sie mit einer externen Kalibrierung ausgewertet und liefern so Rückgewinnungsinformationen bei jeder einzelnen Probe. Bei der Dotierung zur Einwaage bzw. kurz vor kritischen Analysenschritten wie z.B. clean up und Derivatisierung können diese quantitativ überwacht werden.
DOM-1 (Deepoxy-Desoxynivalenol) besitzt als Metabolit von DON analytisch ähnliches Verhalten wie die Leitsubstanz der B-Trichothecene. DesOxynivalenol-Metabolit-1 bietet sich auch aufgrund der relativ kostengünstigen Verfügbarkeit (Fa. Biopure) bei hoher Reinheit und geringer Toxizität als Surrogate an [2]. Die chromatographische Differenzierung zwischen DOM-1 und den B-Trichothecenen ist sowohl in der RP-HPLC [3] als auch in der GC auf verschiedenen Phasenpolaritäten (Bild 1) problemlos möglich [2].

Stabilisotopenverdünnungsanalytik

Interne Standards werden entweder der Messlösung vor der GC-Bestimmung oder bevorzugt der Probe in einem frühen Stadium der Aufarbeitung in definierten Mengen zugesetzt. In ihrer Hauptfunktion dienen sie im Gegensatz zu Surrogates direkt zur Quantifizierung nach der klassischen internen Standardauswertung. Zusätzlich eignen sie sich auch noch hervorragend als Retentionszeit-Referenzen. Im Zuge der Kalibrierung wird das Verhältnis der Peakflächen von Zielanalyten und internem Standard ermittelt und in Beziehung zur Konzentration der Zielanalyten gesetzt.

Da das Flächenverhältnis maßgeblich für die Umrechnung in Konzentrationsergebnisse ist, verursachen schwankende Injektionsvolumina zwischen Kalibrierlösungen und Probenlösungen keine Quantifizierungsfehler mehr. Durch eine präzise Zugabe gleicher Mengen des internen Standards sowohl zu den Kalibrierlösungen als auch zu den Proben können Unregelmäßigkeiten und Verluste während der Aufarbeitung ausgeglichen werden. Dabei sollten die Dotierungen so bemessen werden, dass Messlösungen und Kalibrierlösungen gleiche Konzentrationen des internen Standards aufweisen.

Voraussetzung für die Eignung als interner Standard ist ein möglichst identes physikalisch-chemisches Verhalten im Vergleich zum Zielanalyten. Dieser Forderung werden isotopenmarkierte Zielanalyten am besten gerecht. Sie verhalten sich bei Aufarbeitung, Derivatisierung, Chromatographie und Ionisierung gleich, werden aber bei der MS-Detektion durch die unterschiedlichen Molekulargewichte differenziert.

¹³C₁₅-DON

Zur Markierung (d.h. dem Einbau schwererer stabiler Isotope) bieten sich ¹³C-Atome und die Deuterierung an. Während unter ungünstigen Umständen ein Deuterium/Protonen-Austausch bei manchen Probenmatrizes stattfinden kann, ist die ¹³C-Markierung mit höherem Herstellungsaufwand verbunden, aber in wässrigen Medien auch haltbarer. Bei der Deuterierung wird die Masse des substituierten Elements um 100 %, beim Austausch von ¹²C durch ¹³C nur um 8 % erhöht. Die Änderungen führen zu entsprechenden Differenzen bei den Reaktionsgeschwindigkeiten. „C-H“-Bindungen reagieren 6...10 mal schneller als vergleichbare „C-D“-Bindungen, der Unterschied zwischen ¹²C- und ¹³C-Bindungen beträgt lediglich 4 %, obwohl in beiden Fällen nur 1 Da Unterschied besteht. Dieses differierende Verhalten von nativen und markierten Analyten wird als Isotopeneffekt bezeichnet. Es ist bei ¹³C-Markierung deutlich weniger ausgeprägt. Praktisch macht sich dieser Effekt bei der Kapillar-GC dadurch bemerkbar, dass deuterierte PAHs bzw. d5-Atrazin chromatographisch von den natürlich vorkommenden Ausgangssubstanzen abgetrennt werden können [1].

Ein für die massenspektrometrische Bestimmung von Desoxynivalenol (DON) und weiterer Trichothecene dringend notwendiger interner Standard ist nun mit dem vollständig ¹³C-markierten DON erhältlich (Fa. Biopure Referenzsubstanzen). Aufwändige Tests und Charakterisierungen zeigen die sehr hohe ¹³C-Anreicherung und belegen, dass die „ready to use“-Kalibrierlösung frei von natürlich vorkommendem DON ist [4]. Das Produkt ¹³C₁₅-DON ist damit sowohl für die LC/MS/MS [5] als auch für die folgende GC/MS-Methode sehr gut geeignet.
Die Aufarbeitung der Proben gliedert sich in eine zweistündige Extraktion mit Acetonitril/Wasser (84/16) und ein Multitoxin-Clean-up eines Rohextrakt-Aliquots mittels Festphasenextraktions-Säulen der Fa. Romer Labs. Diese speziell dafür vorgefertigten Einweg-Reinigungskartuschen („MycoSep™ 227 Trich+“) mit einer Mischung von Aktivkohle, Silica, Ionenaustauscherharz etc. eluieren alle Trichothecene und halten einen Großteil der Zerealien-Bestandteile zurück. Dabei ist die Funktionalität des „Solid Phase Extraction“-Materials der Kartuschen auf die Polarität des Extraktionsmittels abgestimmt, dessen Zusammensetzung wiederum dem Azeotrop des Gemisches entspricht. SPE-Kartuschen vom Typ „MycoSep™“ stehen für verschiedene Multitoxin-Applikationen [6, 7, 8] zur Verfügung und zeichnen sich durch ein sehr einfaches und zeitsparendes Handling (30 s) aus.

Nach der Silylierung erfolgt die Messung am GC/MSD (Bild 2). Zur Dotierung des IStd ¹³C₁₅-DON eignet sich der Rohextrakt bzw. das gereinigte Konzentrat vor der Derivatisierung. Der Dotierpunkt vor dem Clean-up ist aus analytischer Sicht optimal, da dann auch dieser wichtige Schritt vollständig unter Kontrolle ist. Kostengünstiger, da Aliquotierungsverluste entfallen, wäre die Zugabe direkt zur Silylierung.

EI-MS und SIM-Auswahl

Je höher der Markierungsgrad, desto größer sind üblicherweise die nutzbaren Unterschiede der Massenspektren zwischen nativen und markierten Analyten. Eine Massendifferenz von z.B. nur 1 Da durch Einfachdeuterierung wäre bei Massenspektrometern ohne Hochauflösung in der Praxis nur schwer verwertbar, zumindest 3 Da Differenz sollten vorgesehen werden. Durch die Markierung aller C-Atome von DON wird ein Molekulargewichtsunterschied von 15 Da erreicht (Bild 3 und 4). Dieser entspricht allerdings auch einer CH₃-Abspaltung, so dass für das „Selected Ion Monitoring“ (SIM) das Molekularion 512 des nativen silylierten DON nicht mehr genutzt werden kann.

Ähnlich verhält sich die Situation beim bisherigen primären DON-Qualifiersignal bei 422 Da. Für SIM sollten aufgrund ihrer geringeren Störanfälligkeit die intensiveren Signale im oberen Massenbereich ausgewählt werden. Sie treten bei DON (als TMS-Derivat) aber meist nicht sehr dominant auf und es muss darauf geachtet werden, dass sie nicht vom markierten internen Standard interferiert werden.
Die um CH₃ reduzierte DON-Molekülmasse 497 kann z.B. als wichtigster Qualifier überlagerungsfrei nahe dem M⁺ mit gutem Signal/Rauschverhältnis genutzt werden (Ql-1). Die Massenspur bei 295 Da zeigt ein kräftiges und auch in Proben störungsfreies Signal und wird daher als Quantifizierungsion für DON eingesetzt (Qn). Das hohe Signal 235 kann als zusätzlicher Qualifier beibehalten werden (Ql-2) (Bild 3 und 5). Umgekehrt konnte mit dem Ion 437 (iQn) ein dominantes SIM-Signal für ¹³C₁₅-DON-TMS gefunden werden, das im nativen DON-Spektrum praktisch nicht vorkommt und daher als Quantifizierungssignal für den IStd geeignet ist.

Die praktische Anwendung des ¹³C₁₅-DON-IStd bei einem „FAPAS Profiency Test“ anhand einer Futtermittelprobe zeigte mit nur 1,2 % Abweichung vom Mittelwert die sehr gute Selektivität und hohe Zuverlässigkeit der GC/MS-Isotopenverdünnungsanalytik (Bild 5). Es ist noch zu prüfen, inwieweit sich ¹³C₁₅-DON auch für weitere B-Trichothecene wie 3-Acetyl-DON, 15-Acetyl-DON, Fusarenon X und mit Einschränkungen eventuell auch für das polarere Nivalenol als interner Standard eignet.

Weitere ¹³C-markierte Mykotoxinstandards

Aufgrund der hohen Toxizität der A-Trichothecene T-2 Toxin und HT-2 Toxin mit deren geringer Selektivität bei nichtspektroskopischen Verfahren ist die MS-Detektion von besonderer Bedeutung. Mit dem neu verfügbaren ¹³C₂₄-T-2 Toxin steht auch für diese Mykotoxingruppe ein aussichtsreicher interner Standard zur Verfügung, der in die gemeinsame GC/MS-Analytik eingebunden werden kann.

Die Standardlösungen werden in Certan^®-Fläschchen abgefüllt, die aufgrund ihrer mechanisch genial einfachen und robusten Konstruktion den wertvollen Inhalt vor dem Auslaufen schützen, selbst wenn das offene Gefäß umfällt. Diese sog. „Ampulle unter den Fläschchen“ verhindert durch die lange enge Öffnung effizient das Ausdampfen vom Lösungsmittel.

Der Trend in der Mykotoxinanalytik verschiebt sich immer mehr in Richtung Multitoxin-Methoden mit LC/MS/MS. Die Tandem-Massenspektrometrie kann mit exzellenter Selektivität überzeugen und moderne Triple-Quadrupole-Systeme zeigen im MRM-Modus (Multiple Reaction Monitoring) enorme Sensitivität [6, 7, 8, 9].

Die Achillesferse dieser Technik liegt (abgesehen von den Anschaffungskosten) trotz höchster Spezifität, bei hoher Matrixbelastung in der Beeinträchtigung der Quantifizierung durch Signalunterdrückungs- bzw. Erhöhungseffekte in der Ionenquelle (meist liegt „Quenching“ vor). Simultan eluierende Matrixbestandteile stören sowohl bei APCI- als auch bei ESI-Quellen die Ionisierung, je nach Probenmaterial noch dazu in unterschiedlichem Ausmaß.

Gegenmaßnahmen wie Verdünnen der Messlösungen und Matrixkalibrierungen zur Reduktion der Abweichungen durch Matrixeffekte schränken die Anwendungen allerdings empfindlich ein. Elegant und befriedigend kann diese Problematik nur durch geeignete, d.h. in der Regel isotopenmarkierte interne Standards, wie die bisher verfügbaren ¹³C₁₅-DON, ¹³C₂₄-T-2 Toxin, ¹³C₃₄-Fumonisin B1 und ¹³C₂₀-Ochratoxin A gelöst werden. Dadurch wird auch die Anwendung der kostspieligen LC/MS/MS-Technik qualitativ aufgewertet.

Fazit

Voll ¹³C-markierte Mykotoxine sind ideale interne Standards für die Verwendung in massenspektrometrischen Analyseverfahren. Mit ¹³C₁₅-DON, ¹³C₂₄-T-2 Toxin, ¹³C₃₄-Fumonisin B1 und ¹³C₂₀-Ochratoxin A der Fa. Biopure stehen zurzeit schon für die wichtigsten Toxingruppen geeignete Kalibrierstandards für die Stabilisotopenverdünnungsanalytik zur Verfügung. Sie sind auch eine wichtige Voraussetzung für die Entwicklung und praktische Anwendung von Multitoxin-Methoden mittels LC/MS/MS.

Literatur

1. Brodacz W., „Interne Standards und Referenzsubstanzen in der GC“, LABO, Leitartikel, S. 8-14, Heft 10, 1997.
2. Brodacz W., „Praktische Erfahrungen mit DOM-1 in der GC-Routineanalytik von Trichothecenen“, ALVA-Mitteilungen, Heft 4, 2006.
3. Freudenschuss M., Häubl G., Jaunecker G., „Deepoxy-desoxynivalenol (DOM-1) als interner Standard für die Typ B-Trichothecene“, ALVA-Mitteilungen, Heft 1, 2004.
4. Häubl G. et al, „Characterization and application of isotope-substituted (¹³C₁₅)-deoxynivalenol (DON) as an internal standard for the determination of DON”, Food Add Contam., 23 (1187-1193), 2006.
5. Häubl G., Berthiller F., Krska R., Schuhmacher R., „Suitability of a ¹³C isotope labeled internal standard for the determination of the mycotoxin Deoxynivalenol by LC-MS/MS without clean-up”, Anal. Bioanal. Chem. 384 (3), pp. 692-696, 2005.
6. Berthiller F., Schuhmacher R., Buttinger G., Krska R., „Rapid simultaneous determination of major type A- and B-trichothecenes as well as zearalenone in maize by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry”, J. Chromatog. A, 1062, 2, pp. 209-216, 2005.
7. Biselli S., Hummert C., „Development of a multicomponent method for Fusarium toxins using LC-MS/MS and its application during a survey for the content of T-2 toxin and deoxynivalenol in various feed and food samples”, Food Add. Contam. 22 (8), pp. 752-760, 2005.
8. Klötzel M., Gutsche B., Lauber U., Humpf H.-U., „Determination of 12 Type A and B Trichothecenes in Cereals by Liquid Chromatography-Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry”, J. Chromatog. 53, 8904-8910, 2005.
9. Sulyok M., Berthiller F., Krska R., Schuhmacher R., „Development and validation of a liquid chromatography/tandem mass spectrometric method for the determination of 39 mycotoxins in wheat and maize”, Rapid Commun. Mass Spectrom. 20, 2649-2659, 2006.