Molekulare Infektionsdiagnostik

RSV in wenigen Minuten ausschließen

Das klinische Bild von Patienten mit Verdacht auf eine Infektion mit RSV (Respiratory Syncytial Virus) ist unspezifisch und die Unterscheidung von anderen akuten respiratorischen Erregern ist schwierig [1, 2]. Die entsprechende Unsicherheit bei der RSV-Diagnose kann zu verzögerten Entscheidungen führen und sich negativ auf Patienten sowie die Abläufe in einem Krankenhaus auswirken. Seit Kurzem sind neue molekulardiagnostische Plattformen erhältlich, die die Leistung einer PCR mit der Geschwindigkeit eines Schnelltests kombinieren.

Das RSV gehört zu den häufigsten Erregern von Atemwegserkrankungen und führt bei Säuglingen, Kindern und älteren Menschen zu Infektionen mit teilweise schweren Verläufen. (Bild: Abbott vormals Alere)

RSV-Erkrankungen können in allen Altersklassen auftreten. Hierbei sind besonders häufig Kleinkinder betroffen, die je nach klinischer Manifestation und Vorgeschichte in unterschiedliche Risikogruppen eingeteilt werden. Etwa 50 – 70 % aller Kinder durchlaufen im ersten Lebensjahr eine RSV-Infektion, fast alle Kinder bis zum Ende des zweiten Lebensjahres. Bei älteren Säuglingen und Kleinkindern ist eine RSV-Infektion die häufigste Ursache von Erkrankungen des unteren Respirationstraktes und von damit verbundenen Krankenhauseinweisungen [3]. In 20–25 % der Fälle führt dies im Krankenhaus zu Pneumonie und in 70 % zu einer Bronchiolitis. Die globale Krankheitsbelastung durch RSV wird auf jährlich 64 Mio. Erkrankungen und 160 000 Todesfälle geschätzt [4].

Die RSV-Saison überschneidet sich mit anderen respiratorischen Erregern wie z.B. Influenza- oder Rhinoviren, was eine spezifische Diagnose weiter erschwert. Eine Infektion erfolgt in der Regel durch Tröpfchen, die beim Husten oder Niesen in die Umwelt entweichen und bei der Kontaktperson durch die Nasenschleimhäute aufgenommen werden. Eine langfristige Immunität gegen RSV ist unmöglich, so dass Reinfektionen in allen Altersgruppen auftreten [5]. Die Richtlinien zum Hygienemanagement von RSV-Infektionen sehen vor, dass Patienten mit Verdacht auf eine mögliche RSV-Infektion isoliert werden, um Ausbrüche der Krankheit zu unterbinden [6]. Das Isolieren von Patienten ist kostenintensiv und empirische, unnötige Isolationen sowie entsprechende Schutz- und Hygienemaßnahmen steigern die Kosten einer Klinik erheblich. Trotz aller Bemühungen ist RSV die häufigste auf Kinder übertragene Infektion in der Klinik [5].

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Um den Verdacht auf eine RSV-Infektion zu bestätigen, wird routinemäßig oft ein Abstrich vom Nasenrachensekret genommen und im Labor mit einer PCR untersucht. Ein Antikörper-Nachweis ist im Vergleich zum direkten Erregernachweis von untergeordneter Bedeutung [3], wird aber verwendet, um eine Vorselektion der Patienten durchzuführen. Um keine RSV-Infektion zu übersehen, werden die vorselektierten negativen Proben mit der PCR noch einmal getestet. Der Nachweis mittels PCR im Labor ist sehr spezifisch und hochsensitiv. Allerdings kann die Zeit für das Testverfahren, den Probentransport und die Ergebniskommunikation Stunden bis Tage dauern. Dies kann zu Unsicherheit und Verzögerung von klinischen Entscheidungen führen und somit Patienten und den Krankenhausapparat belasten.

Bild 2: Alere™-i-RSV-NEAR-Amplifikationsmechanismus in der linearen Phase. 1a) Die Erkennungsregion (RR) von Primer T2 bindet an die Zielsequenz Y’. 2a) Die DNA-Polymerase lagert sich an T2 an und amplifiziert die DNA. 3a) Ein zweiter T2-Primer verdrängt das ursprüngliche T2-Stück, an dem sich eine weitere DNA-Polymerase anlagert und den ersten synthetisierten Strang verdrängt. 4a) T1 bindet an Sequenz X des verdrängten Stranges und wird durch eine Polymerase amplifiziert. 5a) Das synthetisierte Produkt mit NEBS und NECS wird durch eine Nicking-Endonuklease geschnitten. 6a) Eine DNA-Polymerase bindet an die Schnittstelle und amplifiziert das DNA-Produkt (NEAR-Amplifikations-Duplex) bis es die Zielsequenzen und die NEBS und NECS aufweist [8]. (Bild: Abbott vormals Alere)

Folgerichtig ist eine präzise Ein- und Ausschlussdiagnose bei Verdacht auf eine RSV-Infektion essentiell. Hier kann einer patientennahen Labordiagnostik eine immer wichtiger werdende Rolle zuteilwerden. Zwar sind schon seit geraumer Zeit Schnelltests für den RSV-Erregernachweis verfügbar, jedoch ist die Sensitivität dieser Tests nicht ausreichend, um RSV verlässlich auszuschließen. Seit 2016 bietet Abbott (vormals Alere) auf der molekulardiagnostischen Plattform Alere™ i einen RSV-Test an. Die Sensitivität mit 100 % und Spezifität mit 97 % des Alere™-i-RSV-Tests sind mit der einer konventionellen PCR vergleichbar [7]. Die Alere™-i-Plattform ist so konzipiert, dass sie flexibel für die Diagnostik im Labor, aber auch dezentralisiert und patientennah eingesetzt werden kann, um Entscheidungswege zu verkürzen. RSV-Testergebnisse sind in 13 min oder schneller verfügbar [4].

Testprinzip des Alere™-i-RSV-Tests
Grundlage des Alere™-i-RSV-Tests ist eine isotherme Nukleotidamplifikation. Diese erfordert keinen Hitzedenaturierungsschritt, um ein Einzelstrangtarget für die Amplifikation durch eine DNA-Polymerase zu erzeugen. Stattdessen werden eine thermostabile sowie strangverdrängende DNA-Polymerase, eine thermostabile Nicking-Endonuklease und zwei Oligonukleotid-Primer verwendet. Die RSV-A- und RSV-B-Oligonukleotid-Primer besitzen drei spezifische Regionen: Eine stabilisierende Region (SR), die Nicking-Endonukleasebindungs- und -schnittstelle (NEBS und NECS), sowie eine Erkennungsregion (RR) [8]. Der eigentlichen Amplifikation ist eine Reverse-Transkription vorgeschaltet, die aus Virus-RNA cDNA synthetisiert.

Bild 3: Alere™-i-RSV-NEAR-Amplifikationsmechanismus in der exponentiellen Phase. 1b) Zwei Nicking-Endonukleasen schneiden das NEAR-Amplifikations-Duplex. 2b) Die in 1b entstanden Stücke werden durch jeweils eine Polymerase amplifiziert. 3b) Die zwei Teilstücke haben jeweils eine NEBS und NECS, die wiederholt dem Nicking und einer Extension unterzogen werden, wodurch die spezifischen Produkte 1 und 2 synthetisiert werden, die als Target für T2 und T1 dienen. 4b) Die Verlängerung dieser Komplexe erzeugt zusätzliche DNAEinheiten, die einzelne NEBS und NECS enthalten und so eine exponentielle Amplifikation ermöglichen [8]. (Bild: Abbott vormals Alere)

Die Amplifizierungsreaktionen für RSV A und B erfolgen separat. Die Amplifikationsziele für RSV A und B sind das Nichtstrukturprotein-2-Gen (NS2) und das Nukleocapsid-Gen (N). Das Amplifikations-Produkt sind zwei komplementäre Oligonukleotide, die eine eindeutige Speziesidentifikation möglich machen [9].

Isotherme Amplifikation
Bild 2 und 3 illustrieren schematisch die lineare und exponentielle Amplifikationsphase, welche sich in unterschiedliche Phasen untergliedern lässt (Schritte 1-6).

Bild 4: Das Alere™-i-System. (Bild: Abbott vormals Alere)

Detektion der Amplifikate
Das Alere™ i verwendet fluoreszenzmarkierte molekulare Sonden für die sensitive und spezifische Echtzeitdetektion. Die Sonden enthalten ein Fluorophor und einen Quencher an gegenüberliegenden Enden. Wenn sich Fluorophor und Quencher in unmittelbarer räumlicher Nähe befinden, führt dies zu einer Eliminierung der Fluoreszenz. Durch das Binden der Sonde an die spezifische Sequenz des Amplifikats, wird der Abstand zwischen dem Fluorophor und dem Quencher vergrößert, sodass eine messbare Fluoreszenz detektiert werden kann. Die Menge an freigesetzter Fluoreszenz ist direkt proportional zu der Menge an spezifischem Amplifikat [8]

Das Alere™ i verwendet unterschiedliche Fluoreszenzkanäle, um zwischen der Amplifikation einer Probe und der internen Kontrolle unterscheiden zu können. Die Verfahrenskontrolle wird auf dem Display vermerkt. Die Fluoreszenzkurven werden vom Gerät berechnet und anschließend dem Anwender qualitativ als RSV-positiv- oder RSV-negativ-Ergebnis angezeigt. Zusätzlich wird auf dem Display vermerkt, ob die Verfahrenskontrolle einwandfrei funktioniert hat [4].

Qualitätskontrolle beim Alere™ i
Bei jedem Test läuft eine interne Kontrolle mit. Diese besteht aus einem RNA-Oligonukleotid, welches ebenfalls die reverse Transkription und den isothermen Amplifikationsprozess durchläuft. Der Nachweis der IC erfolgt über eine Sonde, die das vom IC-RNA-Oligonukleotid erzeugte Produkt spezifisch nachweist [8]. Zusätzlich sind in einem Test-Kit externe Positiv- wie auch Negativ-Kontrollen enthalten [4].

Praktischer Arbeitsablauf
Das Alere™ i (Bild 4) ist die erste molekulardiagnostische Plattform, die in den USA mit dem CLIA-Waiver zertifiziert wurde [10]. Jeder Arbeitsschritt wird dem Anwender auf dem Display per Video nachvollziehbar angezeigt. Eine eindeutige farbliche Kennzeichnung der Testkomponenten unterstützt hierbei die Einfachheit der Abarbeitung [4].

Durch die einfache Handhabung des Gerätes und der Tests ist jede Fachkraft ohne langjährige Laborerfahrung in der Lage, das Instrument zu bedienen und ein aussagekräftiges Ergebnis zu erhalten [10]. Mehr Komfort bei der Lagerung der Reagenzien wird durch eine Raumtemperaturlagerung einiger Tests ermöglicht. Dies ermöglicht es, die Tests sofort zu verwenden, um zeitnah und im direkten Patientenkontakt die Ergebnisse zu besprechen.

Die neue Generation von Schnelltests
Das Alere™-i-System ist eine echte Point-of-Care-Plattform, die Tests mit der Geschwindigkeit eines konventionellen Schnelltests und der Präzision einer molekulardiagnostischen Methode bietet. Schnelldiagnosen mit erhöhter Sensitivität sind für den zuverlässigen Nachweis von RSV unerlässlich, da sie umgehend wirksames Patientenmanagement ermöglichen. Die schnelle und genaue Diagnose von RSV kann zu kürzeren Krankenhausaufenthalten und geringeren Kosten, zu reduzierter Verwendung antimikrobieller Mittel, zu weniger sekundären Komplikationen und zur wirksamen Umsetzung von Infektionskontrollmaßnahmen führen.

AUTOR
Nicolas Peschkov
Junior Product Manager

Toxicology & Klinische Chemie DACH Abbott vormals Alere GmbH, Köln
E-Mail: serviceDE@alere.com
http://www.alere.com

Referenzen
[1] Popow-Kraupp, T. et al. Diagnosis of Respiratory Syncytial Virus Infection. Open Microbiol J, 2011, Vol. 5, Suppl 2-M2, p 128-134.

[2] Prendegast, C. et al. Rapid Antigen-based Testing for Respiratory Syncytial Virus; Moving Diagnostics From Bench to Bedside? Future Microbiol J, 2013, Vol. 8, Nr. 4, p 435-444.
[3] RKI, RKI-Ratgeber für Ärzte, Respiratorische Synzytial-Virus-Infektionen (RSV), 2015, online unter: [https://www.rki.de/DE/Content/Infekt/EpidBull/Merkblaetter/Ratgeber_RSV.html] Stand 01.03.2018.
[4] Alere™ i RSV Packungsbeilage, Online unter: [https://www.alere.com/de/home/product-details/alere-i-rsv.html]. Stand 01.03.2018.
[5] Sun Y. & Lopez C. B. The innate immune response to RSV: advances in our understanding of critical viral and host factors, Vaccine, 2016, Vol. 35, p 481–488.
[6] Bont L. Nosocomial RSV, Infection control and outbreak management. Paediatr Respir, Rev. 2009, Vol. 10, Suppl 1, p 16–17.
[7] Pfeil J, et al. Screening for respiratory syncytial virus and isolation strategies in children hospitalized with acute respiratory tract infection, Medicine, 2014, Vol. 93, p 144.
[8] Food and Drug Admistration (FDA), Premarket Notification 510(k) - K151464 Decision Summary,2015, online unter: [https://www.accessdata.fda.gov/scripts/cdrh/cfdocs/cfpmn/pmn.cfm?ID=K151464] Stand 01.03.2018.
[9] Food and Drug Admistration (FDA), Premarket Notification 510(k) - K161375 Decision Summary, 2016, online unter: [https://www.accessdata.fda.gov/scripts/cdrh/cfdocs/cfpmn/pmn.cfm?ID=K161375] Stand 01.03.2018.
[10] Food and Drug Admistration (FDA), CLIA - Clinical Laboratory Improvement Amendments, 510(k) - K171792 Decision Summary, 2017, online unter: [https://www.accessdata.fda.gov/scripts/cdrh/cfdocs/cfCLIA/Detail.cfm?ID=40544&NoClia=1] Stand 01.03.2018.


Hintergrund:
Abbott Laboratories hat im Frühjahr 2017 den Diagnostik-Spezialisten Alere gekauft. Abbott vormals Alere bietet Point-of-Care-Tests an, mit deren Hilfe Ärzte zwischen behandlungsbedürftigen und selbstregulierenden Atemwegsinfektionen unterscheiden können. Darüber hinaus umfasst das Produktportfolio weitere diagnostische Lösungen, die den Nachweis von Pathogenen am Point-of-Care und die frühzeitige Abstimmung einer geeigneten Behandlungsstrategie unterstützen können.

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