Konditionierung, Schutz und Werterhalt von GC-Kapillarsäulen

Das Bluten von GC-Trennphasen

Säulenbluten ist ein allgemeines Problem in der Gaschromatographie, das aus dem permanenten Abbau des Phasenmaterials resultiert. Massiv verschlechterte Trennleistung und Detektorkontamination sind die Folgen.

Konditionierung, Schutz und Werterhalt von GC-Kapillarsäulen

Die GC-Säule ist das Herz der gaschromatographischen Trennung. Die wichtigsten Auswahlkriterien dafür sind Polarität, Inertheit und Blutungsverhalten. Robuste und temperaturfeste Kapillaren sind auf Verbesserungen bei der Polymerchemie und Fortschritte bei der Desaktivierung und beim Herstellungsverfahren zurückzuführen.

In geringem Ausmaß ist Säulenbluten eine natürliche Begleiterscheinung des thermischen Stresses, dem die Kapillarsäule bei erhöhter Temperatur ausgesetzt ist. Kommen noch Sauerstoff und/oder Probenkontaminationen dazu, wird das Säulenbluten zum ernsten Problem für die Lebensdauer, Inertheit und Polarität der Phase.

Renommierte Hersteller bieten Kapillaren in einer großen Dimensionsvielfalt und mit einer breiten Palette von Phasenpolaritäten an. Neben dem thermisch relativ gering belastbaren Polyethylenglykol-Typ (PEG) spielen die Polysiloxan-Phasen (PS) mit Abstand die wichtigste Rolle in der GC. Die Variabilität und die wesentlich höhere thermische und chemische Toleranz begründen den Erfolg der gebundenen PS-Phasentypen.


Phasentypen

Die Substitution der Methyl-Seitenketten durch verschiedene funktionelle Gruppen bietet vielfältige Möglichkeiten zur Variation von Polarität und Selektivität der stationären GC-Phasen. Inertheit und Blutungsverhalten bestimmen deren Qualität. In Tabelle 1 sind die gebräuchlichsten PS-Typen mit ihren strukturellen Zusammensetzungen aufgelistet.

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Die Trennmechanismen der üblichen funktionellen Gruppen von Polysiloxan-Phasen und deren Ausprägung sind in Tabelle 2 dargestellt (zum Vergleich ist auch Polyethylenglykol als die polarste Phase angeführt).

Die Polarität einer Säule bezieht sich auf die Art und Weise, wie die Analyten mit der stationären Phase in Wechselwirkung treten. Da die Dispersions-Wechselwirkung mit dem Dampfdruck des Analyten korreliert, kann vereinfacht angenommen werden, dass die Analyten auf unpolaren Säulen (Typ-1) meist nach ihren Siedepunkten eluieren. Mit steigender Polarität kommen noch weitere Retentionsmechanismen dazu, so dass mittelpolare Säulen sowohl auf Basis der Siedepunkte als auch nach dem Grad der Wechselwirkungen, wie induzierte Dipole oder der Fähigkeit zu Wasserstoffbrückenbindungen, trennen. Der Trennmechanismus stark polarer Phasen beruht fast ausschließlich auf den Interaktionen zwischen den funktionellen Gruppen von Analyt und Phase.

Die Säulenpolarität beeinflusst auch die Analysentemperatur. Polare Analyten z.B. werden auf polaren Säulen stärker retardiert, wodurch höhere Temperaturen zur Elution notwendig sind und somit stärkeres Bluten auftritt.


Säulenbluten

Bluten ist ein normaler Abbauprozess des stationären Phasenpolymers. Es steigt proportional mit der Phasenmenge in der Säule und vor allen Dingen exponentiell mit der Temperatur an. Es handelt sich dabei letztlich um einen permanenten thermodynamischen Gleichgewichtsprozess, bei dem sich das Siloxanpolymer der Phase in thermodynamisch stabilere Strukturen umbaut. Bild 1 zeigt am Beispiel der üblichen Polysiloxangerüste den dabei auftretenden sog. „Back-Bite“-Mechanismus, der zu zyklischen Siloxanen (Ringe mit 3...5 Si) führt, welche wesentlich stabiler sind. Reaktive Gruppen am Phasenuntergrund fördern die Kettenbrüche, und O2-Einbrüche katalysieren diese zusätzlich.

Seitens der Hersteller werden große Anstrengungen unternommen, blutungsarme und inerte Säulen zu entwickeln. Die ersten Schritte dazu sind die Verbesserung der Fused-Silica-Oberfläche sowie die Optimierung der Desaktivierungsmethoden und des Herstellungsprozesses des Polymers.

Die z.B. deutlich verbesserte Phase DB-1ms zeigt im Vergleich zu ihrer Vorgängerversion DB-1 ein deutlich reduziertes Bluten bei sehr hohen Temperaturen (Bild 2). Obwohl beide als 100%-Methyl-PS-Phasen praktisch gleiche Polarität und Selektivität aufweisen und die Massenspektren des Blutens das gleiche Pattern zeigen, wird das Signal-Rausch-Verhältnis (S/N) bei der DB-1ms wesentlich verbessert.

Der Basepeak 207 stammt dabei vom hauptsächlich gebildeten Siloxan-Ring in Bild 2 (oben). Verbesserte Sensitivität (hohes S/N), höhere Maximaltemperatur und damit kürzere Analysenzeiten, geringere Detektorverschmutzung, verbesserte Spektrenqualität und längere Lebensdauer sind die wichtigsten Vorteile von sog. „ms“-Säulen. Ihre Stärken kommen nicht nur bei empfindlichen GC-MS-Applikationen zur Geltung, sie sind auch bei hochsensitiven Detektoren wie ECD und NPD in der Spurenanalytik von Vorteil.


Arylen-Technologie

Um das „Back Biting“ zu erschweren, wurde versucht, das Siloxan-Gerüst zu versteifen. Durch den gezielten Einbau von Arylen-Elementen (anstelle von O) in den „Backbone“ des Polymers konnte die Kettenbruchneigung weiter unterdrückt werden. In Bild 3 sind die Strukturen von Typ-5-Phasen eines großen Säulenproduzenten dargestellt. Bei der aktuellen „ms“-Säulengeneration ist die Arylen-Modifikation gezielt darauf abgestimmt, neben erhöhter Stabilität gleiche Polarität zu erzielen. In bestimmten Einzelfällen sind jedoch geringfügige Selektivitätsunterschiede zu den „alten“ Phasen bemerkbar.

Die Weiterentwicklung der Polymerchemie auch bei den höheren Polaritäten führte schließlich zur „Arylen-Technologie der zweiten Generation“ (Beispiele: DB-35ms, DB-17ms, DB-225ms). Ein weiteres Produkt dieser Technologie ist z.B. die Spezialphase DB-XLB („EXceptionally Low Bleed“). Sie ist auf geringstmögliches Bluten getrimmt und keiner bisherigen Phase direkt zuzuordnen.

Da ein gewisses Bluten bei den besten Säulen permanent stattfindet, stellt sich die Frage: Welche Blutungsrate ist normal? Es ist schwierig, das normale Bluten von Phasen nummerisch exakt zu definieren. Tabelle 3 soll helfen, die Größenordnung des üblichen Blutungsausmaßes diverser Phasentypen unter Normalbedingungen darzustellen. Die groben Bereiche entsprechen der Differenz des Blutens bei niedriger Temperatur (z.B. 100...140 °C) und der stärksten Blutungsrate beim jeweiligen oberen Temperaturlimit der Phase (z.B. 325 °C). Die Messungen erfolgten in Picoampere bei Verwendung des universellen Flammenionisationsdetektors (FID).

Hauptfeind Sauerstoff

Der „natürliche Feind“ der Trennphase bei höherer Temperatur ist definitiv der Sauerstoff im Trägergas. Die Maximalkonzentration sollte 1 ppm nicht übersteigen. Billigere Qualitäten müssen unbedingt mit Sauerstoff-Filtern nachgereinigt werden. Selbst bei Gasqualitäten von 5.0 (entspricht 99,999 Vol% reines Trägergas) empfiehlt sich grundsätzlich noch ein „Oxigen-Trap“ zur zusätzlichen Absicherung gegen schwankende Gasqualität, Luft-Einbrüche beim Flaschenwechsel, versteckte Lecks, etc.

Am besten sollte die Filterpatrone erst nach allen Ventilen und Druckreglern so nahe wie möglich beim Gerät positioniert werden und über einen Indikatorteil verfügen, der per Farbumschlag das Kapazitätsende signalisiert. Trotzdem muss man zwischen GC und Filter einen Absperrhahn einplanen, damit bei stillgelegtem Gerät eine Rückdiffusion von Luft zum Filter verhindert wird („rückwärtige“ Deaktivierung des O2–Traps).

Gasreinigungssysteme mit selbstabsperrender Basis und Aufsteckfiltern haben sich gut bewährt. Bei Abnahme einer Filterpatrone wird der Gasweg automatisch abgesperrt. Ob in Serie geschaltete Filter mit Aktivkohle, Feuchtigkeits-Trap und Sauerstoff-Trap oder „All in one“-Kombinationspatronen verwendet werden, ist eine Frage des Platzes und der notwendigen Kapazität.

Bei Kombi-Filtern gibt es zumindest weniger Verbindungsschnittstellen und damit weniger Risiko für Lecks.

Als Leitungen eignen sich praktisch nur Kupfer (häufig verwendet) und Edelstahl (selten). Keinesfalls dürfen Kunststoffleitungen Verwendung finden, denn sie sind nicht diffusionsdicht und können Verunreinigungen abgeben. Metallleitungen müssen jedoch absolut frei von Maschinenölspuren oder sonstigen Kontaminationen sein. Im Zweifelsfall sollten sie mit rückstandsanalytischen Lösungsmitteln (Methanol, n-Hexan, etc.) gereinigt und dann gut mit dem reinen Gas ausgeblasen werden. Halogenierte Lösungsmittel wie Dichlormethan, etc. sind zwar gut fettlösend und flüchtig, aber absolut tabu, wenn ein Electron Capture Detektor (ECD) betrieben werden soll.


GC-MS

In der GC-MS ist es von besonderer Bedeutung, das Säulenbluten zu minimieren, da es die Nachweisgrenze (NG) signifikant verschlechtern kann. In erster Linie muss die Qualität des Trägergases zumindest mit Reinigungsfiltern gegen Sauerstoff auf eine möglichst hohe Qualität gebracht werden, aber auch Feuchtigkeit und Kohlenwasserstoffe sollten eliminiert werden. Dann ist es naheliegend, die bereits erwähnten „ms“-Phasen mit besonders niedriger Blutungsneigung („low bleed“) einzusetzen und diese vor der ersten Verwendung gut zu konditionieren. Dabei sind bei Polysiloxan-Phasen die Spaltprodukte mit den Ionen 207, 267 und 281 im Auge zu behalten. Das Massenspektrometer ist dabei auch ein exzellentes Instrument zur Beurteilung der Gasqualität.

Die Präsenz von nennenswerten MS- Signalen bei 28 m/z für Stickstoff und 32 m/z für Sauerstoff weist auf Undichtigkeiten direkt im GC-MS-System hin. Für den Einlass am MS sollten jedenfalls Vespel-Dichtungen (mit geringem Graphit-Anteil) und keinesfalls das nicht vakuumdichte, reine Graphit verwendet werden. Vespel-Dichtungen können allerdings oft bei großen und häufigen Temperaturschwankungen (schnelle und steile Temperaturprogramme) dazu führen, dass sie sich durch den unterschiedlichen Ausdehnungskoeffizienten, im Vergleich zu den umgebenden Metallflächen, im Laufe längerer Sequenzen lockern und undicht werden. Das ist ein entscheidender Nachteil gegenüber Metalldichtungen. Denn spezielle Metall-Ferrul-Systeme wie z.B. SilTite® (Fa. SGE) sind für dieses Problem konzipiert worden und für die Reinheit des Vakuums besonders empfehlenswert, auch wenn sie bei der Installation etwas mehr Erfahrung und viel Fingerspitzengefühl beim Anziehen der Mutter erfordern.

Wird im MS praktisch kein O2 festgestellt, aber erhebliche Konzentrationen an N2, dann ist eher eine Undichtigkeit der Zuleitung vor dem Sauerstoff-Gasreinigungsfilter in Betracht zu ziehen. Es diffundiert in diesem Fall offenbar Luft (auch gegen den deutlich höheren Innendruck!) in die undichte Zuleitung, der Sauerstoff wird aber großteils noch im vorhandenen O2-Filter gebunden. Geht dessen Kapazität jedoch zur Neige, beginnt bei höheren Ofentemperaturen sofort die massive Schädigung der GC-Phase.


Konditionierung

Vor Verwendung einer Kapillarsäule sollte sie entsprechend den Herstellerangaben konditioniert werden. D.h. die Säule wird in den GC eingebaut, mit Trägergas gut durchgespült und dann thermisch nachgereinigt. Bei dieser Gelegenheit muss ein alter GC-Mythos widerlegt werden: Früher galt die Lehrmeinung, dass beim Konditionieren das Säulenende nicht im Detektor eingespannt sein soll, damit das abblutende Material diesen nicht kontaminiert. Das mag in der Anfangszeit der Säulentechnologie wohl sinnvoll gewesen sein. Heute sind zumindest die Phasen moderner Kapillarsäulen so gut vernetzt, stabil und vorkonditioniert, dass diese Vorsichtsmaßnahme meist nicht mehr notwendig ist.

Vielmehr kann sie auch kontraproduktiv sein: Kommt es durch winzige Lecks im GC-System und/oder der Gaszufuhr bzw. ungenügender Reinheit des Trägergases zu einer erhöhten O2-Konzentration, kann es gerade bei den sehr hohen Temperaturen der Konditionierung zu einer massiven Dauerschädigung der Phase kommen. Ist die Säule vollständig installiert, d.h. auch am Detektor angeschlossen, würde anhand des abnorm hohen Signalverlaufs eine beginnende Schädigung sofort auffallen. Der unverzügliche Abbruch der Hochtemperaturbehandlung wäre dann dringend nötig.

Es ist also empfehlenswert, den Signalverlauf des angeschlossenen Detektors aufmerksam zu verfolgen, während die Säulentemperatur von z.B. 50 °C mit einer Steigerungsrate von ca. 10 °C/min auf Höchsttemperatur gebracht wird. Höchsttemperatur bedeutet 10...20 °C über der maximalen, geplanten Methodentemperatur bzw. die sog. zulässige Höchsttemperatur der Säule. Das Temperatur-Limit für den programmierten Betrieb (siehe Hersteller-Spezifikation) darf dabei keinesfalls überschritten werden.

Im Laufe der Konditionierung beginnt die Basislinie ab einem bestimmten Temperaturniveau etwa 30 min lang ständig zu steigen, um dann innerhalb von rund 30...90 min stetig abzusinken (Bild 4, schwarze Kurve).

Je nach Säulentyp und Dimension sollte nach etwa 1...3 h ein flacher Kurvenverlauf erreicht sein. Stabilisiert sich die Basislinie nicht und bleibt hoch und/oder schwankt stark, muss ein Sauerstoffeinbruch oder unreines Trägergas, etc. vermutet und die Konditionierung abgebrochen werden. Polare Phasen und Dickfilmsäulen brauchen etwas länger für die gewünschte Signalstabilität als dünne unpolare Phasenfilme.

Die schwarze Kurve in Bild 4 zeigt den typischen Signalverlauf einer Konditionierung mit dem hochempfindlichen Micro-ECD und einer unpolaren Phase.

Lässt man dasselbe Temperaturprogramm nach der Konditionierung gleich noch einmal laufen, darf man nur mehr einen vergleichsweise sehr geringen Signalanstieg und ein deutlich niedrigeres Signalplateau erhalten (rote Kurve). Steigt das Signal hingegen wiederum stark an oder tauchen noch Peaks auf, muss von einem schädigenden O2-Anteil im Gas oder Kontamination im Injektor ausgegangen werden.

Unerwünschte Peaks, die im Laufe eines Temperaturprogramms im Chromatogramm auftauchen, dürfen nicht mit Säulenbluten verwechselt werden. Sie stammen meist aus einem verunreinigten Injektorblock oder vom Septum. Von diesen externen Quellen abgehende flüchtige Substanzen bleiben z.B. am kühlen Säulenanfang hängen und beginnen mit dem Temperaturgradienten des Ofenprogramms durch die Säule zu eluieren. Bei höheren Temperaturen erscheinen sie durchaus auch als scharfe Peaks. Typische Blutungsmuster von Injektor-Septen bzw. Verschlusskappengummis, wie sie bei Autosampler-Probefläschchen verwendet werden, sind in Bild 5 gegenübergestellt. Sie unterscheiden sich vom Säulenbluten durch das charakteristische Peakmuster.

Um die Säule als Ursache auszuschließen, kann man Injektor und Detektor mit einer unbelegten Kapillare (Retention Gap) „kurzschließen“. Bei einem verschmutzten Einspritzblock bzw. Septumkrümel im Injektor-Liner zeigt sich dann ein entsprechender Signalanstieg analog zum Temperaturprogramm (der fehlende „purge & trap“-Effekt verhindert aber ausgeprägte Peaks).


Backflush

Der Eintrag von schwer- bis unflüchtigen Verunreinigungen aus dem Probenmaterial in die GC-Säule lässt sich in der Routineanalytik nicht immer vollständig vermeiden. Unflüchtige Ablagerungen am Beginn der Kapillare müssen meist durch Abschneiden der ersten Windung eliminiert werden (Auf die Möglichkeit der Rückspülung mit Lösungsmitteln soll hier aus Platzgründen nicht eingegangen werden, da dadurch auch manchmal die Inertheit von Säulen leiden kann).

Bei Probenbestandteilen, die wesentlich weniger mobil sind als die Zielanalyten, trotzdem aber in der Säule migrieren, empfiehlt sich die sog. Backflush-Technik zur Schonung der Kapillare und zur wesentlichen Verkürzung der Gesamtchromatographiezeit. Denn während z.B. besonders bei Headspace- bzw. Thermodesorptions-Applikationen die gesuchten Verbindungen die Trennsäule rasch durchlaufen, benötigt die Elution der schwereren Probenbestandteile unverhältnismäßig viel Chromatographiezeit, obwohl sie nicht von Interesse sind. Selbst bei Erhöhung der Ofentemperatur auf die maximale thermische Belastungsgrenze muss Zeit in die thermische Reinigung („Bake out“) und die Wiederabkühlung investiert werden. Zusätzlich leidet die GC-Phase stark unter dieser Beanspruchung und blutet entsprechend.

Die Backflush-Systeme der GC-Hersteller beruhen im Prinzip auf der Deans-Schaltung, bei der über entsprechend variierbare Differenzdrücke zwischen Säulenanfang und Säulenende der Gasfluss dirigiert werden kann (Beispiel-Aufbau siehe Bild 6).

Im Normalfall überwiegt der Druck auf der Injektorseite, so dass der Gasfluss mit allen migrierenden Probenbestandteilen vollständig zum Detektor geleitet wird (Bild 7, oben).

Schwer flüchtige Probenbestandteile, die nicht thermisch („mit Gewalt“) aus der Säule getrieben werden, schlagen sich dabei mit jeder Injektion als neue Kontaminationen im Vorderteil der Kapillare ab. Mit jedem Temperatur-Zyklus wandern sie jedoch etwas weiter in die Säule hinein (Bild 7, oben in Rot, Gelb u. Blau).

Beim Säulen-Backflush hingegen wird die Gasflussrichtung nach Elution des langsamsten Zielanalyten umgekehrt, indem der Säulenvordruck reduziert und der Druck am 3-Wege-Splitter erhöht wird (Bild 7, Mitte).

Zusammen mit einer erhöhten Ofentemperatur ist die Dauer der Backflush-Periode maßgeblich dafür verantwortlich, dass der Großteil der stark retardierten Kontaminationen sofort wieder über die Injektorseite ausgetrieben werden kann (Bild 7, unten).

Für die technische Realisierung der Umschaltung kommen hochinerte Micro- Channel-Flow-Elemente zur Anwendung, die sehr geringe thermische Massen aufweisen, direkt im GC-Ofen montiert sind und mittels Electronic Pressure Control (EPC) gesteuert werden (Bild 8).

Fazit

Aufgrund verbesserter Herstellungsverfahren und der sog. Arylen-Technologie zeichnen sich moderne „ms“-Kapillarsäulen durch Inertheit und sehr geringes Bluten bei gleichzeitig hoher thermischer Belastbarkeit aus.

Die hohe Qualität der Trennkapillaren bleibt beim Anwender allerdings nur erhalten, wenn Fehler beim Konditionieren, Kontaminationen durch Probenrückstände und Belastungen durch eindiffundierenden Sauerstoff vermieden bzw. minimiert werden.

Wolfgang Brodacz
AGES Österreichische Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit,
Lebensmittelsicherheit,
Kontaminantenanalytik
4020 Linz
E-Mail: wolfgang.brodacz@ages.at

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