Vom komplexen Experten-Tool zur „Easy“-Web-Applikation

GC-Trennungen schnell und einfach simulieren

Die Computersimulation von GC-Chromatogrammen ist ein wertvolles Hilfsmittel zur raschen Optimierung aller Trennparameter. Besonders das Konzept der sog. Thermodynamischen Retentionsindizes hat sich seit 1992 als schnell und präzise bewährt. Zur effektiven Nutzung erfordert es allerdings gute theoretische Kenntnisse über alle relevanten gaschromatographischen Zusammenhänge und Erfahrung in der Entwicklung von Temperaturprogrammen. Eine Weiterentwicklung ermöglicht es nun auch GC-Einsteigern, rasch zu guten GC-Problemlösungen zu gelangen.

Für die Vorstellung dieser einfachen und benutzerfreundlichen Web- basierten GC-Simulation-Applika-tion gibt es zwei Gründe. Der erste ist ein persönlicher, da der Autor vor mehr als 20 Jahren einer der Ersten in Österreich war, der sich u.a. näher mit der GC-Simulation auf Basis des innovativen TRI-Konzepts (Thermodynamische Retentionsindizes) beschäftigt hat [1, 2, 3, 4, 5]. Die anfängliche Skepsis über die praktische Eignung eines solchen GC-Simulationsprogramms (DOS-Programm „ezGC“) war fast so groß wie die anschließende Begeisterung über die Schnelligkeit und Präzision, mit der Chromatogramme auf Knopfdruck vorausgesagt werden konnten. Der Autor hat dieses Programm sehr intensiv für die Pestizid- und PCB-Analytik mit den damaligen Standarddetektoren ECD und NPD und der üblichen Absicherungen auf zwei GC-Phasen unterschiedlicher Polarität genutzt. Die GC-MS-Messungen von PAHs und jene von leichtflüchtigen Kohlenwasserstoffen, etc. (Head Space) sind nur einige Beispiele aus dem umweltanalytischen Bereich. Für die Bestimmung des Fettsäuremusters und der Sterolzusammensetzung wurden etliche Anwendungen für die FID-Detektion optimiert [6]. Nicht zuletzt wurden umfangreiche Optimierungen für Trichothecen-Mykotoxine erfolgreich durchgeführt [7, 8]. Über die klassische Optimierungs-Anwendung hinaus bewährte sich das Modell auch für den Transfer von GC-Methoden [9, 10].

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Der zweite, objektiv wichtigere Grund, ist eine Innovations-Auszeichnung. Die Web- basierte Simulations-Software EZGC® war 2014 ein Gewinner des jährlichen „Analytical Scientist Innovation Awards“ (TASIAs). Laut den Juroren des Innovationspreises „…kann die Zeit bis zu den (ersten) Ergebnissen erheblich reduziert werden, so dass Labore bei drängenden Fragestellungen schneller Lösungen finden….“

Thermodynamische Retentionsindizes TRI
Schon 1992 wurde von Analytical Innovations Inc. in Zusammenarbeit mit einem großen Säulenhersteller die auf DOS basierenden GC-Simulationsprogramme „ezGC“ bzw. „Pro ezGC“ entwickelt. Die Pro-Version enthielt eine einfache TRI-Bibliothek, die für gängige Substanzen (Limitierung auf 99 Analyten) sofortige Simulationen ermöglichte, ohne dass sie unter verschiedenen Bedingungen chromatographiert werden mussten.

Bild 1: Chromatogramm aller 41 Pestizide und PCBs mit allen Trennparametern.

Die computergestützte GC-Trennungsoptimierung dieser nicht gerade billigen Software-Produkte basierte auf dem Konzept der sogenannten „thermodynamischen Retentionsindizes“ (TRI). Sie setzen sich aus Enthalpie- und Entropiedaten zusammen und beschreiben das chromatographische Verhalten jedes Analyten auf einer bestimmten stationären Phase. Ein großer Vorteil ist, dass sie unabhängig von der Säulengeometrie und den pneumatischen Parametern sind.

Für ihre Berechnung sind zwei Kalibrierexperimente mit linearen Temperaturprogrammen notwendig, deren Steigungen sich um den Faktor 2...4 unterscheiden. Die daraus resultierenden Retentionszeiten und Halbwertsbreiten fließen ebenso in den Berechnungsalgorithmus ein wie die Säulenparameter (Länge, Innendurchmesser und Filmdicke) und alle pneumatischen Einflussgrößen (Trägergas, Vordruck, Enddruck, etc.). Diese werden zur Verbesserung der Vorhersagepräzision zusätzlich noch durch exakte Totzeit-Messungen kontrolliert und gegebenenfalls korrigiert. Das zugrundeliegende mathematische Modell ist damit in der Lage, die thermodynamischen Retentionsindizes jedes Analyten und die sog. „Coating Efficiency“ der Kapillare (Maßzahl für die Qualität der Phasenbelegung) zu berechnen. Mit Hilfe dieser Kennzahlen, einer bestimmten Säulendimension und der Pneumatik-Vorgaben können dann mit dem integrierten Simulations-Algorithmus für jedes beliebige Temperaturprogramm auf Knopfdruck Retentionszeiten und Halbwertsbreiten jedes gewünschten Analyten vorhergesagt werden. Die daraus berechneten Auflösungsinformationen bzw. die optische Beurteilung der simulierten Chromatogramme ermöglichen eine rasche Erfolgskontrolle der jeweiligen (mehrstufigen) Temperaturprofile.

Durch wiederholte Variation der Temperaturprogramme, welche nach eigenen Vorgaben automatisch generiert werden können (mehrere Millionen Varianten pro Stunde bis Tag), wird der optimale Temperaturverlauf für eine maximale Auflösung bei kürzester Analysenzeit ermittelt. Darüber hinaus ist es auch möglich, Länge, Innendurchmesser und Filmdicke der Säulen zu verändern bzw. diverse Gasfluss-Änderungen vorzunehmen und damit wiederum mit Millionen von Temperaturprogrammen zu kombinieren. Am Ende einer kompletten Trennungsoptimierung stehen für eine bestimmte stationäre Phase die ideale Geometrie der Kapillare und das optimale Temperaturprogramm fest.

Bild 2: Ergebnistabelle von 41 Pestiziden und PCBs mit rot markierten Auflösungsdefiziten und den Links zu weiteren Informationen (Lupe).

Effektive Experten-Software
Für die damalige Zeit, das heißt in der Ära der 486er-Prozessoren, war das Programm sehr schnell und ermöglichte erstmals eine präzise Vorhersage und Darstellung von realistischen Chromatogrammen. Leider konnten wegen des begrenzten Speicherplatzes nur maximal 100 Substanzen simuliert werden.

Außerdem war ein fundiertes chromatographisches Verständnis unbedingt erforderlich, um wirklich effektiv Methoden entwickeln zu können. Das Programm war schnell und präzise, aber nicht intelligent. Nur GC-Experten mit dem entsprechenden Fachwissen und einer Portion Entwicklungserfahrung konnten das Tool hocheffizient nutzen und eine rasante Beschleunigung des Optimierungsprozesses erzielen. Voraussetzung waren meist auch die Berechnung der TRIs, eine fachgerechte Durchführung von Totzeit-Messungen, entsprechend sinnvolle Vorgaben für die Ziel-Auflösung und entsprechende Vorgaben von erfolgversprechenden Parametern aus dem Ranking der Zwischenergebnisse. Die Vorgaben über z.B. niedrige Starttemperaturen für Splitless-Injektionen bzw. mögliche höhere Temperaturen im Split-Modus musste der Anwender beisteuern. Die Auswahl der erwartungsgemäß erfolgreichen Phasen-Polaritäten wurde alleine vom Anwender getroffen, wozu gewisse Grundkenntnisse unbedingt erforderlich waren.

Gravierende Änderungen bei der Weiterentwicklung der verschiedenen Windows-Betriebssystem-Versionen führten zu Kompatibilitätsproblemen. Unter Windows Vista bzw. Windows 7 ist das Programm nur noch in einer virtuellen Maschine lauffähig und in Windows 8 funktioniert es gar nicht mehr.

Bild 3: Chromatogramm-Zoombereich von unzureichend aufgetrennten Peaks (die Strukturen und Zusatzinformationen werden über die Ergebnistabelle aufgerufen).

Evolution in Richtung Vereinfachung
2010 wurde die Entscheidung getroffen, die Software nicht mehr an die sich ständig verändernden Windows-Varianten anzupassen, sondern ein völlig neues Konzept umzusetzen. Ausgehend von den Wünschen vieler unerfahrener Anwender, die einfach und schnell und vor allem auch ohne Expertenwissen zu einem Modell gelangen möchten, das für ein Trennproblem eine sofortige Phasenempfehlung, Dimensionierung der Kapillarsäule sowie ein optimiertes Temperaturprogramm zurückmeldet, wurde das Konzept dahingehend verändert.

Das angestrebte neue Programm sollte auf Knopfdruck „gute“ Ergebnisse, im Sinne von „alle Zielanalyten werden in kürzester Zeit möglichst basisliniengetrennt“, liefern. Vorgabe für die Weiterentwicklung der Applikation war primär die sehr einfache Nutzung auch für GC-Einsteiger, die keine oder nur wenig Erfahrung ha- ben. Dazu notwendig war allerdings auch eine entsprechend umfangreiche TRI-Bibliothek mit verschiedensten GC-Phasentypen. Derzeit sind ca. 10 000 Verbindungen eingepflegt, die entsprechend den Anwenderanfragen nach und nach erweitert werden. In den Kalkulationen werden 17 verschiedene GC-Phasen von 100 % Methyl (völlig unpolar) bis zur WAX-Phase (sehr polar) berücksichtigt. Alles was der Anwender letztlich wissen muss: Welche Analyten will ich analysieren?

Um eine Plattform-unabhängige Anwendung zu ermöglichen, wurde eine Web-basierte Applikation gewählt, die auf die hohe Prozessorleistung und den großen Speicher von Linux-Web-Servern zurückgreift und von PCs, Macs, Tabletts und Smartphones mittels Firefox, Chrome, IE (≥ 8), Safari und Opera aufgerufen werden kann. Damit wird eine schnelle Rückmeldung für den Anwender sichergestellt, der immer nur von der aktuellsten Software-Version bedient wird. Als neuer Name wurde „EZGC® Chromatogram Modeler“ kreiert.

Bild 4: Überlagerte EI-Massenspektren eines Co-eluierenden Peak-Paares (19+20) zur schnellen Selektion geeigneter SIM-Ionen für beide Zielanalyten.

Schnell und unkompliziert
Nach einer kurzen Registrierung ist man als kostenloser User freigeschaltet und braucht sich in Folge dann nur mehr mit Passwort anmelden (www.restek.com/ezgc). Für eine neue Aufgabenstellung ist es lediglich erforderlich, die Substanznamen der Analyten (in der englischen Nomenklatur) in ein Eingabefeld zu tippen. Eleganter ist die Übertragung einer ganzen Liste von Zielanalyten im Copy/Paste-Verfahren.

Mit Beendigung der Eingabe wird in Sekundenschnelle die geeignetste GC-Phase mit der am besten geeigneten Säulendimensionierung (Länge, Innendurchmesser und Filmdicke) sowie dem optimierten Temperaturprogramm vom Web-Server zurückgemeldet. Die Berechnung des Modells für z.B. 41 Pestizide und PCBs dauerte nur einen unmerklichen Augenblick (Bild 1).

Die Ergebnistabelle (Bild 2) enthält die Retentionszeiten, die Halbwertsbreiten und die daraus resultierenden Auflösungen zum jeweils nächstgelegenen Peak. Auf ungenügende chromatographische Resolution wird farbig (Gelb bis Rot) hingewiesen. Selbstverständlich kann in den simulierten Chromatogrammen nach Belieben gezoomt werden (Bild 3).

Ein zweckmäßiges Feature sind die auf Knopfdruck verfügbaren Zusatzinformationen (Strukturen, Molgewicht, etc. via Lupe in Bild 2), und insbesondere das EI-Massenspektrum jedes Analyten, welches Massenzahlen mit vier Nachkommastellen bereithält (High Resolution). Besonders interessant ist dabei die Möglichkeit, bei Co-Elution von zwei Peaks auf Knopfdruck deren Massenspektren farblich codiert übereinander zu legen. Damit können sehr einfach für beide Analyten jene SIM-Ionen selektiert werden, welche nicht vom überlappenden Nachbar-Peak beeinflusst werden (Bild 4, Seite 24).

Wird im Nachhinein ein Zielanalyt ergänzt oder auch herausgenommen, erfolgt umgehend der aktualisierte Modellvorschlag, wobei es ohne Weiteres vorkommt, dass sich auch die vorgeschlagene GC-Phase ändert. Bei speziellen Fragestellungen, die das Programm nicht automatisch löst, kann eine Anfrage an den Betreiber gesendet werden, wobei auch alle beteiligten Substanzen mit übertragen werden können.

Die einzig wirkliche Herausforderung an den unbedarften Anwender ist die Eingabe der Analytnamen, denn die Schreibweise hat sich der englischen Nomenklatur anzupassen. Daher wurde eine Synonym-Datenbank mit CAS-Nummern und bis zu einem Dutzend unterschiedlicher Bezeichnungen hinterlegt. So ist zum Beispiel auch darauf zu achten, dass jeder Analyt für sich und exakt eingegeben werden muss. So wird zum Beispiel „m/p-Xylene“ (für Xylol) nicht gefunden, während sowohl „m-Xylene“ als auch „p-Xylene“ selbstverständlich vorhanden sind.

Zusätzlich online verfügbar bzw. zum Download (Win 7/8/Vista/XP) freigegeben, sind ein „Flow Calculator“ und „Method Translator“, mit denen die Randbedingungen des vorgeschlagenen Modells beliebig abgeändert werden können. Damit ist es relativ einfach, das Trägergas, den Vordruck samt Modus (constant Flow, etc.), die Säulenabmessungen und den Säulenendruck (Vakuum von Massenspektrometern) zu ändern, oder eine Methode zugunsten von Geschwindigkeit oder Effizienz zu optimieren.

In der Praxis fällt auf, dass auch die Web-Variante, wie schon bei der bisherigen Offline-Software, so konzipiert ist, dass die Peakweiten eher etwas breiter angenommen werden. Das bedeutet, dass die Abschätzung der Auflösungen etwas zu pessimistisch ist, was wiederum mehr Sicherheit beim realen Chromatogramm bedeutet.

Die Übereinstimmung der Simulation mit den realen Retentionszeiten [11] ist, berechnet über 22 Substanzen (in 15 min), mit durchschnittlich 3,1 % (0,24 min) nur geringfügig schlechter als mit selbst berechneten TRIs. Das ist nicht verwunderlich, wird doch für die TRI-Berechnung und die Realmessung im zweiten Fall nicht nur dieselbe Phase, sondern auch exakt dieselbe Kapillarsäule im selben GC verwendet [1].

Zur Überprüfung der Response-Geschwindigkeit wurde eine umfangreiche Trennaufgabe mit 233 (!) Verbindungen gestellt. Nach dem Start werden Dutzende von GC-Phasen und Säulen-Dimensionen überprüft und schon nach ca. 25 s werden die Retentionszeiten, Peakbreiten und Auflösungen aller 233 Verbindungen samt Chromatogramm dargestellt.

GC-Phasen-Alternativprodukte
Die vorgeschlagenen GC-Säulen sind natürlich Produkte jenes Herstellers, der diese Software kostenlos auf seiner Homepage zur Verfügung stellt. Für fast alle Phasentypen gibt es allerdings von verschiedensten Herstellern gleichwertige Alternativen. Eine exemplarische Übersicht dazu ist in der Tabelle beigefügt. Praktisch jeder seriöse Säulenhersteller hält auf seiner Homepage sog. Cross-Referenz-Listen bereit, welche über die Äquivalenz seiner Phasen zu jenen der Mitbewerber Auskunft geben (z.B. [12, 13, 14]). Nur bei Spezialphasen, deren ganz gezielt entwickelte Polarität und Inertheit an eine bestimmte Applikation angepasst wurde, oder wenn im Zweifelsfall die Gleichheit mit alternativen Produkten nicht sichergestellt werden kann, ist man auf die vorgeschlagene Säule angewiesen.

Fazit
Der „EZGC® Chromatogram Modeler“ hilft nicht nur Anfängern, sondern auch erfahrenen Anwendern, eine von Grund auf neue Methode einschließlich der Säule und der optimierten Bedingungen rasch zu entwickeln. Dazu ist nur die Analyten-Liste notwendig. Im Gegensatz zu bereits fertigen Applikationsdatenbanken erlaubt diese Anwendung eine äußerst flexible Anpassung der Verbindungsschar. Man ist jedoch darauf angewiesen, dass die eigenen Zielanalyten in der Bibliothek vorhanden sind. Gängige Substanzen, die z.B. in üblichen Messprogrammen gefordert werden, sind jedenfalls umfangreich vorhanden.

Eine Einbeziehung von unbekannten, aber reproduzierbaren Störsubstanzen, die aus der Matrix oder von Chemikalien stammen, bzw. Derivatisierungs-Nebenprodukte können im Gegensatz zur klassischen GC-Simulationssoftware nicht mit einbezogen werden. Es sollte daher ein Add-on-Tool („Expertenmodus“) geben, mit dem eine gesonderte TRI-Bestimmung für unbekannte Verbindungen auf der aktuellen Phase ermöglicht wird.

Ausgehend von der empfohlenen Modell-Phase kann, abgesehen von wenigen Spezial-phasen, fast immer auch auf vergleichbare Phasen von verschiedensten Herstellern zurückgegriffen werden.

Literatur

[1] W. Brodacz, Computersimulation in der Gaschromatographie - Praktische Erfahrungen mit GC-Simulationsprogrammen. LABO, Leitartikel, S4-13, Heft 8, Juli/August 1995.
[2] W. Brodacz, Trennungsoptimierung in der Kapillar-GC 1. Teil: Temperaturprogramm und GC-Simulation. Labor-Praxis, S48-52, Februar 1996.
[3] W. Brodacz, Trennungsoptimierung in der Kapillar-GC 2. Teil: GC-Simulation und Optimierungsstrategien in der Praxis. LaborPraxis, S46-54, März 1996.
[4] W. Brodacz, Effiziente GC-Methodenentwicklung mit Computersimulation und TRI-Bibliotheken. LABO, S32-37, Februar 2000.
[5] W. Brodacz, Computersimulation – ein wertvolles Hilfsmittel für die Entwicklung und Optimierung von GC-Trennungen. Österreichische Chemie Zeitschrift, S4 – 7,17; Ausgabe Jänner/Februar, 1/2001.
[6] W. Brodacz, Schnelle GC-Analytik von Sterolen zur Überwachung des Tierfett-Verbotes in Futtermitteln. LABO, S32-37, Juli 2001.
[7] W. Brodacz, Optimierte GCTrennungen in der Mykotoxinanalytik. LaborPraxis LP 6, S 26 – 28; Juni 2004.
[8] W. Brodacz, Auswahl von GC-Phasen und Optimierung von Trichothecen-Trennungen mittels Computersimulation. Mycotoxin Research Vo. 21, No. 1, S11-14, 2005.
[9] W. Brodacz, Computersimulation für den Transfer von GCMethoden Teil 1. LaborPraxis, S84-91, Februar 1997.
[10] W. Brodacz, Computersimulation für den Transfer von GCMethoden Teil 2. LaborPraxis, S46-49, März 1997.
[11] http://blog.restek.com/?p=12217.
[12] http://www.chem.agilent.com/en-US/products-services/Columns-Sample-Preparation/GC-GC-MS-Columns/Pages/restek.aspx.
[13] www.supelco.com.tw/A-1%20%20%20207-235%20New.pdf. Supelco Cross-Reference Chart. Table 3. Supelco Capillary GC Columns with Comparable Columns from Other Manufacturers.
[14] http://www.phenomenex.com/gc-column. GC Säulen-Kreuzreferenz nach Phase.
[15] http://www.restek.com/Chromatography-Columns/GC-Columns/GC-Column-Cross-Reference-Columns-by-Phase (GC Column Cross-Reference: Columns by Phase).

Wolfgang Brodacz
AGES Österreichische Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit Lebensmittelsicherheit – Kontaminantenanalytik
4020 Linz
E-Mail: wolfgang.brodacz@ages.at

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