Sein oder Nichtsein

Teil 1: Identifizierungskriterium für die Chromatographie

Die Retentionszeit ist in der Gaschromatographie wie auch in der Hochdruckflüssigkeitschromatographie das primäre Erkennungsmerkmal für alle Zielanalyten. Selbst bei den modernsten Detektionstechniken wie der hochauflösenden Massenspektrometrie (HRMS) oder der Tandem-Massenspektrometrie (MS-MS) wird eine chromatographische Auftrennung vorgeschaltet. Trotz der enormen Selektivität dieser Hochleistungsdetektoren bleibt die Retentionszeit-Information der Chromatographie ein wichtiges Kriterium bei der Identifizierung.

Die derzeitigen Regulatorien beziehen sich, neben den Ionenverhältnissen in der MS, welche im 2. Teil dieses Artikels ausführlich behandelt werden, auch auf die notwendigen Toleranzen bei der chromatographischen Peakzuordnung. Die Unterschiede betreffen nicht nur die Höhe der Abweichungen, sondern auch, ob diese absolut oder relativ anzuwenden sind.

Regulatorien
Zum Ersten gelten für verschiedene Applikationen unterschiedliche gesetzliche Vorgaben. Selbst für die Pestizid-Analytik unterscheiden sich die Regulatorien von z.B. EU und USA (siehe Tabelle). Um einen umfassenden Überblick zu bieten, wurde der Vergleich auch auf Tierarzneimittel und die Doping-Analytik ausgedehnt:

  • EU: Commission Decision 2002/657/EC Veterinary Drugs (Verbotene Stoffe u. Mykotoxine etc.).
  • EU: SANCO/12495/2011 bzw. SANCO/ 12571/2013 Guidance Document for Pesticide Residue.
  • USA: FDA (Food and Drug Administration) ORA-LAB.10 for Pesticides in Food and Feed USA: FDA 118 Guidance for Industry - Mass Spectrometry for Confirmation of the Identity of Animal Drug Residues.
  • USA: USDA PDP (United State Department of Agriculture, Pesticide Data Program).
  • World Anti-Doping Agency WADA TD2010IDCR.
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Bild 1: Variabilität der absoluten Retentionszeit-Abweichungen von den Referenzmittelwerten in zwei Pestizid-Labors, aufgetragen gegen die LC-Retentionszeit (RT). Absolutes Abweichungskriterium (SANCO/12571/2013 in Rot) im Vergleich zu einer zu großzügigen Regelung mit relativen Toleranzen (±2,5 % in Grün). © Bilder 1, 2, 4 mit freundlicher Genehmigung von Dr. Hans Mol (RIKILT).

Die Gegenüberstellung in der Tabelle zeigt aufgrund der vergleichbaren Fragestellung erwartungsgemäß teilweise ähnliche Vorgaben für Retentionszeit-Abweichungen, aber auch deutliche Unterschiede in den entscheidenden Details.

Manche Regelungen basieren hauptsächlich auf Expertenmeinungen und weniger auf experimentell ermittelten Daten, sind schon älter und berücksichtigen daher nicht die moderne Geräteentwicklung. Die z.B. 2002 in Kraft getretene und rechtlich verbindliche Entscheidung „2002/657/EC“ der EU-Kommission wurde nie aktualisiert und beruht letztlich auf dem Gerätestand vom Ende der Neunzigerjahre. Damals wurde auch noch nicht berücksichtigt, dass sich die Analytik in Richtung minimalisierter Clean-up-Verfahren bis hin zu „Dilute and Shoot“ mit einem sehr hohen Anteil an Matrixbestandteilen bei ständig abgesenkten Limits entwickelt. Das heißt, bei aktuellen Multimethoden ist einerseits mit wesentlich größeren Matrix-Störungen zu rechnen, während gleichzeitig immer niedrigere Schadstoffkonzentrationen sicher gemessen werden müssen.

Dr. Hans Mol, ein international anerkannter Experte für massenspektrometrische Spurenanalytik am Forschungsinstitut RIKILT (Wageningen, NL) und dort verantwortlich für die Analytik von Pestiziden und natürlichen Toxinen, hat die Identifizierungskriterien verschiedenster internationaler Regulatorien verglichen, hinterfragt und erstmals systematische Untersuchungen über die experimentelle Variabilität der entscheidenden Identifizierungskriterien Retentionszeit und Ionenverhältnis durchgeführt [2]. Für die Pestizidanalytik wurden 120 aktuelle Pestizide in drei Konzentrationsstufen mit 21 typischen Matrizes verschiedenster Klassen herangezogen. Die Messungen erfolgten auf fünf aktuellen LC-MS/MS-Systemen unterschiedlicher Hersteller in verschiedenen Laboren, so dass letztlich 135 000 extrahierte Ionenchromatogramme manuell überprüft werden mussten. Die Erkenntnisse sind in der Zwischenzeit für die Pestizidanalytik in ein Richtlinien-Dokument (SANCO/12571/2013) eingeflossen, das Empfehlungen dafür zusammenfasst. Eine Erweiterung für die Mykotoxinanalytik erstreckte sich zusätzlich auf die Messung von über 4000 Mykotoxin-Matrix-Konzentrations-Kombinationen [3].

Tabelle: Vergleich von chromatographischen Identifizierungskriterien der Regulatorien in der organischen Schadstoffanalytik und der Dopinganalytik (Retentionszeit-Toleranzen) (1).

Retentionszeit-Variationen in der HPLC
Bei der Auswertung aller o.g. Messungen ergab sich eine Standardabweichung der absoluten Retentionszeit (bezogen auf den Mittelwert aller Kalibrierstandard-Injektionen „Ref-RT“) von < 0,02 min (< 1,2 s). Nur ein Labor (Nr. 5), das keinen LC-Säulenofen verwendet, hatte dadurch deutlich größere Abweichungen (Bild 1, unten).

In der Chromatographie-Praxis ist weit verbreitet, dass die Toleranz für die Retentionszeiten, d.h. das Peak-Erkennungsfenster, als relativer Wert in Prozenten definiert wird. Manche Regulatorien (z.B. 2002/657/EC) schreiben ein solches relatives Retentionszeitfenster sogar vor.

Plottet man die Retentionszeit-Abweichungen gegen die Retentionszeit, so zeigt sich aber deutlich, dass die Variabilität der Retentionszeit-Abweichungen nicht von der Retentionszeit beeinflusst wird (Bild 1).

Bild 2: Variabilität der relativen Retentionszeit-Abweichungen von Referenzmittelwerten in zwei Pestizid-Laboren, aufgetragen gegen die relative LC-Retentionszeit (RRT). Die relative Toleranz von ±2,5 % (lt. Regelung 2002/657/EC) ist in Rot eingezogen.

In manchen Labors ist es auch übliche Praxis, eine sogenannte relative Retentionszeit zur Identifizierung heranzuziehen. Dabei wird die Retentionszeit jedes Zielanalyten auf die Retentionszeit einer Referenzsubstanz oder auch eines internen Standards bezogen, um Schwankungen von Lauf zu Lauf möglichst gut auszugleichen. Die experimentellen Daten zeigen bei dem oben genannten Ausreißer-Labor Nr. 5, dass sich dadurch die Reproduzierbarkeit der Retentionszeiten merklich verbessern lässt (siehe Bild 2, unten). Das heißt, dass kleine Änderungen der Flussrate, insbesondere bei langen Sequenzen, durch die Retentionszeit-Referenz kompensiert werden können.

Die Auswertung aller Daten über die vier Labore mit grundsätzlich gut stabilen Retentionszeiten (Säulenthermostatisierung) relativiert allerdings diese Erkenntnis.

Betreibt ein Labor gut gewartete HPLC-Geräte und insbesondere mit einem Säulenofen zur Thermostatisierung der Trennsäule, so sind die relativen Standardabweichungen sowohl für die Retentionszeit als auch für die relative Retentionszeit sehr ähnlich und für 96 % aller Pestizide unter 0,5 % bzw. < 1 % für 98 % aller Analyten.

Bild 3: HPLC-ESI-MS/MS-Chromatogramm von 17 nativen Mykotoxinen (blau) und 13 voll-13Cmarkierten Mykotoxinen (Rot) als ideale interne Standards mit perfekter Retentionszeitübereinstimmung (für die grün geschriebenen Toxine standen keine Isotopenstandards zur Verfügung). HPLC: C18 150 x 4,6 mm; 5 μm; 1 ml/min (Methanol/Wasser-Gradientenelution).

Absolute Toleranzen bevorzugt
Bei einer Wiederholung der Retentionszeit-Messungen unter Matrixeinfluss, d.h. die Pestizide wurden in den Extrakten verschiedenster Produkte untersucht, waren die Retentionszeit-Abweichungen für alle Matrizes und alle Geräte fast immer unter 0,05 min und praktisch immer kleiner als 0,1 min (Bild 1). Damit bestätigt sich auch im Beisein von Störsubstanzen dieselbe Erkenntnis: Die absoluten Retentionszeit-Abweichungen sind praktisch unabhängig von der Retentionszeit!

Als Erklärung dafür kann Folgendes gelten: Für diese Analytik wird praktisch nur die Gradientenelution verwendet. Die Zeit, welche die jeweiligen Pestizide tatsächlich eluieren, ist in der Praxis ziemlich gleich, da spät eluierende Analyten anfangs am Kopf der Trennsäule retardiert bleiben, bis die Lösungsmittel-Zusammensetzung stark genug für deren Elution ist (d.h. ausreichend unpolar in der RP-LC). Denn erst wenn sich die Analyten tatsächlich durch die Säule bewegen, sind sie den Fluktuationen der Flussrate ausgesetzt.

Relative Retentionszeiten sind für die klassische Multikomponentenanalytik mittels Gradientenelution nicht sinnvoll, weil relative Kriterien nur dann angebracht sind, wenn die Abweichung mit der Retentionszeit ansteigt, was hier eindeutig nicht der Fall ist. Auch würden zum Beispiel 5 % Abweichung wie in der Regelung „2002/657/EC“ erlaubt, bei 1 min Retentionszeit eine Fensterbreite von 0,05 min ergeben und am Ende des Chromatogramms bei 20 min würde die Gesamttoleranz eine volle Minute betragen, was eindeutig viel zu großzügig ist. Es ist daher für die Retentionszeit nur ein absolutes Toleranz-Kriterium angemessen!

Bild 4: Variabilität der absoluten (oben) bzw. relativen (unten) Retentionszeit-Abweichungen von den Referenzmittelwerten, aufgetragen gegen die GC-Retentionszeit (RT; oben) bzw. die relative GC-Retentionszeit (RRT; unten). Das absolute Abweichungskriterium von ±0,2 min (SANCO/12571/2013 in Rot, oben) deckt praktisch alle Messungen ab.

Bei aktueller, moderner Hardware mit konstanter Säulen-Temperatur sind üblicherweise ±0,1 min Toleranz ausreichend. Die Verwendung von relativen Retentionszeiten bringt, egal ob mit relativer oder absoluter Toleranz, keine signifikanten Verbesserungen der Erkennungs-Präzision in der Chromatographie.

Offensichtlich sind aktuelle LC-Systeme ausreichend stabil und eine einzelne Referenzsubstanz kann das Verhalten von vielen anderen nicht wirklich gut korrigieren. Es gibt daher keine Rechtfertigung, bei einer relativen Retentionszeit-Messung noch strengere Kriterien anzuwenden als bei den absoluten Retentionszeiten.

Isotopenmarkierte Standards bevorzugt
In diesem Zusammenhang muss auf eine Ausnahme hingewiesen werden, die noch dazu sehr zu empfehlen ist. Isotopenmarkierte interne Standards verhalten sich praktisch gleich oder sehr ähnlich wie deren native Zielanalyten und zählen daher zur Königsklasse bei der massenspektrometrischen Quantifizierung. Neben ihrer Hauptfunktion, der Kompensation von Matrixeffekten jeder Art, stellen sie auch die beste Korrekturmöglichkeit für individuelle Retentionsschwankungen dar. Insbesondere 13C-markierte Analoge zeigen völlig idente Retentionszeiten bei GC- und HPLC-Trennungen, da sie einem wesentlich geringeren sog. Isotopeneffekt unterliegen als deuterierte Analoge, die merkliche Retentionsunterschiede aufweisen. Obwohl nicht immer für alle Zielanalyten (z.B. in der Pesti- zidanalytik) lückenlos erhältlich, so sind mit zunehmender Verbreitung von MS-Methoden doch ständig mehr gelabelte Standards verfügbar. Durch die individuelle Korrektur mit z.B. voll 13C-markierten Mykotoxin- Analogen (Bild 3) kann die Retentionszeit-Toleranz in diesen Fällen sogar auf z.B. ±0,05 min (3 s; absolut) reduziert werden.

Bild 5: Vergleich der Peak-Erkennungsfenster von derivatisierten Mykotoxinen (B-Trichothecene) in der GC. Eine derzeit gültige Regelung (schwarze Markierungen) erlaubt mit einer relativen Toleranz von ±2,5 % eine unnötig großzügige Peakzuordnung, während ein absolutes Kriterium (±0,1 min.; rote Markierungen) ausreichend wäre.

Bei Realproben können darüber hinaus bestimmte Umstände zu zusätzlichen Varia- tionen der Retentionszeit-Abweichungen führen. In der Gaschromatographie z,B. bewirken Überladungen der stationären Phase Veränderungen der Peakform und in Folge auch Retentionszeit-Differenzen. In der HPLC wiederum sind besonders bei pH-sensitiven Analyten schon geringe pH-Unterschiede kritisch, die ebenfalls zu substanzspezifischen (nicht allgemeinen) Retentionszeit-Verschiebungen führen können. Daher muss in diesem Zusammenhang unbedingt davon abgeraten werden, während einer laufenden Sequenz das Laufmittelreservoire der HPLC nachzufüllen. Denn bei den üblichen und einfachen Herstellungsverfahren von Laufmittel-Zusammensetzungen können schon einmal geringfügige Unterschiede des pH-Wertes von Batch zu Batch auftreten. Solange ein Batch innerhalb einer Sequenz nicht verändert wird, kann allerdings keine Verschiebung auftreten. Die grundsätzliche Möglichkeit, dass die genannten Sonderfälle vorkommen können, muss vom erfahrenen Analytiker aber immer im Auge behalten werden. Nur mit isotopenmarkierten internen Standards können selbst solch außergewöhnliche Abweichungen automatisch erkannt und sicher korrigiert werden.

Retentionszeit-Variationen in der GC
Ein ganz ähnliches Bild wie in der LC ergibt sich bei der Auswertung von GC-Retentionszeit-Messungen mit über 4000 Pestizid- Matrix-Konzentrations-Kombinationen. Bild 4 oben zeigt, dass alle Retentionszeit-Abweichungen unter 0,2 min liegen. Das entspricht genau der 2014 aktualisierten SANCO-Regelung. Differenzen über 0,1 min sind mit 0,9 % aller Fälle die Ausnahme. So wie in der Gradienten-HPLC gilt auch in der temperaturprogrammierten Gaschromatographie, dass eine relative Retentionszeit-Messung (ohne isotopenmarkierte interne Standards) unangebracht ist und die relative Toleranz von ±2,5 % der 657-Regelung zu großzügig dimensioniert ist (Bild 4 unten grüne Markierung).

Eine deutliche Reduktion des relativen Erkennungsfensters um den Faktor 5 auf ±0,5 % (rote Markierung in Bild 4 unten) erscheint eher gerechtfertigt und schließt immerhin noch 97,7 % aller Abweichungen ein. Das belegt auch die grafische Darstellung der Peak-Erkennungsfenster im GC-ECD-Chromatogramm von derivatisierten Mykotoxinen auf einer unpolaren Säule in Bild 5.

Während die schwarz markierten Fensterbreiten (entsprechen der Regelung 657) viel zu groß sind und sich teilweise über zwei Peakbereiche (D, E) erstrecken, ist im Routinebetrieb des Autors ein absolutes Peakfenster von ±0,1 min ausreichend (rote Markierung).

In diesem Beispiel würde darüber hinaus durch eine Störsubstanz der Analyt B in Folge der allzu großzügigen Toleranz vorgetäuscht werden (blauer Erkennungsbereich vs rotes Erkennungsfenster). Die grün markierte Retentionszeit-Referenzsubstanz Mirex dient auch zur Kontrolle der Quantifizierung (von der Injektion bis zum ECD-Response).

Fazit und Empfehlungen
Bei der Multikomponentenanalytik mittels Gradienten-(U)HPLC bzw. in der temperaturprogrammierten GC ist die Variation der Retentionszeit unabhängig von der Retentions- zeit. Die Toleranz für die Retentionszeit ist daher als absoluter Wert anzugeben und oft ist eine Abweichung von ±0,1 min innerhalb einer Sequenz grundsätzlich erreichbar. Relative Retentionszeit-Regelungen bringen dabei keinen wesentlichen Vorteil, es sei denn, für jeden Zielanalyten stehen z.B. 13C-markierte interne Standards zur Verfügung.

Im ungeregelten Bereich, d.h. wenn keine vorgegebenen, gesetzlichen Regulatorien bestehen, kann Folgendes empfohlen werden:

  • Die Chromatographie sollte so gestaltet werden, dass die Retentionszeit des erst-eluierenden Zielanalyten zumindest die doppelte Totzeit überschreitet.
  • Das chromatographische Erkennungsfen-ster sollte ein absoluter Wert im Bereich von ±0,1...0,2 min sein.

Literatur
[1] Steven J. Lehotay, Yelena Sapozhnikova, Hans G.J. Mol, „Current issues involving screening and identification of chemical contaminants in foods by mass spectrometry“; TrAC Trends in Analytical Chemistry, Volume 69, June 2015, Pages 62–75.

[2] H.G.J. Mol, et al., „Identification in residue analysis based on liquid chromatography with tandem mass spectrometry: Experimental evidence to update performance criteria“; Analytica Chimica Acta 2015; Volume 873, 11 May 2015, Pages 1–13.

[3] H.G.J. Mol, et al., „Identification criteria for determination of mycotoxins in food and feed“; EURL-workshop mycotoxins, Geel, 15-16 October 2014.

Wolfgang Brodacz
AGES Österreichische Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit Lebensmittelsicherheit – Kontaminantenanalytik
4020 Linz
E-Mail: wolfgang.brodacz@ages.at

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