Nach einem Gutachten des Bundesministeriums für Gesundheit von 2017 ist die Bekämpfung von Antibiotikaresistenzen eine der größten Herausforderungen für die globale Gesundheitspolitik. Jährlich infizieren sich deutschlandweit etwa 500 000 Menschen bei stationärer Behandlung in Krankenhäusern, aber auch im ambulanten Bereich nehmen diese Risiken zu. Durch geeignete Maßnahmen wäre ein großer Teil solcher Infektionen vermeidbar.

„Lange Zeit nutzte man vorrangig Carbapeneme, um Infektionen zu bekämpfen, die durch resistente Erreger entstehen“, erklärt Rosemarie Preyer, Mitglied der Geschäftsleitung bei der AID Diagnostika GmbH. „Aber die zunehmende Resistenzentwicklung vor allem bei Escherichia coli im Vergleich zur eher stabilen oder gar leicht rückläufigen methicillin-resistenten Staphylococcus aureus ist ein ernstes Thema im jüngsten Bericht des European Centre for Disease Prevention and Control.“

Bild 2a: Enterobakterien, darunter vor allem Escherichia coli und Klebsiella-Stämme, haben aufgrund der Ausbildung verschiedener ß-Laktamasen eine erweiterte Resistenz entwickelt. Quelle: Sebastian Karkus/pixelio.de, Cornelia Menichelli/pixelio. de, WikiImages/pixabay.com

Nachweis der Mutationen zur Antibiotikaresistenz
Auf Grund der Ausbildung von Carbapenem-hydrolisierenden ß-Laktamasen bilden Enterobakterien, vor allem Escherichia coli und Klebsiella-Stämme, mehrfache Resistenzen gegenüber Antibiotika aus. Durch Punktmutationen können sogar die besonders gefährlichen Laktamasen mit erweitertem Wirkungsspektrum entstehen – die sogenannten Extended Spectrum ß-Lactamases (ESBL). „Diese Enzyme lösen einen gemeinsamen Bestandteil aller ß-Lactam-Antibiotika auf: den ß-Lactam-Ring“, erklärt Preyer. „ESBL inaktivieren dadurch Arzneimittel, die häufig in der Therapie eingesetzt werden. Darunter fallen beispielsweise Cephalosporine der dritten und vierten Generation oder Penicillin, aber auch Monobactame, die bei Patienten mit einer Allergie gegenüber bestimmten Medikamenten eingesetzt werden.“

Um solche Resistenzmechanismen zuverlässig zu diagnostizieren, entwickelte AID auf Basis von epidemiologischen Analysen ein Resistenzprogramm, das die am weitesten verbreiteten ESBL-Gene in Enterobakterien in Europa sowie Nordamerika identifiziert. Es beruht auf der Methode der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) mit anschließender reversen Hybridisierung. Rosemarie Preyer: „Die reproduzierten DNA-Abschnitte, auch Amplifikate genannt, werden denaturiert und an sequenzspezifische Gensonden auf dem Nitrocellulose-Streifen gebunden. Dank verschiedener Waschschritte im Anschluss bleibt diese Bindung nur bestehen, wenn die Sequenz der Sonde vollständig mit dem kopierten DNA-Abschnitt übereinstimmt. Dadurch wird die Genauigkeit der Analyse garantiert.“

Bild 2c: Enterobakterien, darunter vor allem Escherichia coli und Klebsiella-Stämme, haben aufgrund der Ausbildung verschiedener ß-Laktamasen eine erweiterte Resistenz entwickelt. Quelle: Sebastian arkus/pixelio.de, Cornelia Menichelli/pixelio. de, WikiImages/pixabay.com

Fehlerlose Testergebnisse in kürzester Zeit
Die Interpretation der Daten geschieht durch eine eigens entwickelte Software, die Ergebnisse einfach und übersichtlich darstellt. „In einer Studie am Institut für Medizinische Mikrobiologie in Zürich wurden 185 kulturpositive Urine mit einer Bakterienlast von >10⁴/ml mit dem AID-ESBL-Assay getestet“, so Preyer. „182 dieser Proben waren auswertbar und zeigten eine ausgezeichnete Kongruenz zur phänotypischen Resistenztestung mit Kultur.“ Ebenso wurden 171 phänotypisch negative Urine sowie 11 ESBL-positive Isolate richtig erkannt. Die wichtigsten Mutationen in Laktamase-Genen für TEM und SHV können innerhalb von 5 h erfasst werden. Außerdem erkennt der Assay das plasmidcodierte CTX-M und die Carbapenemase KPC, die ebenfalls zu Resistenzen gegenüber Arzneimitteln führen können.

Zur Diagnose von 13 weiteren Carbapenemase-Genen bietet AID ein zusätzliches Kit an. „Mit ihm lassen sich zuverlässig AIM, BIC, DIM, GIM, IMI, IMP, KPC, NDM-1, NMC-A, OXA-48, SIM, SPM und VIM entdecken“, so Preyer. „Dafür wurde der Line-Probe-Assay erfolgreich auf seine Aussagefähigkeit hin untersucht und in der Routine-Labordiagnostik am Institut für Medizinische Mikrobiologie der Universität Zürich implementiert.“ Somit konnte insbesondere der Nutzen zur schnellen Detektion von Carbapenemase-Genen in 151 klinischen Bakterienstämmen ausgewertet werden. Bisher wurden diese Stämme phäno- und genotypisch charakterisiert. 113 dieser Stämme, die keine Carbapenemase produzierten, dienten dazu, das Risiko falsch-positiver Resultate zu evaluieren. Das Ergebnis der Studie belegte die Sensitivität und Spezifität des Tests, da alle Zuordnungen zu 100 % korrekt waren. Hierbei erwies sich die Handhabung zudem als schnell und einfach. Weiterhin entfallen größere Investitionen für die Anschaffung spezieller Geräte.

Bild 3: Um solche Resistenzmechanismen zuverlässig zu diagnostizieren, entwickelte AID auf Basis von epidemiologischen Analysen einen ESBL-Line-Probe-Assay, der die am weitesten verbreiteten ESBL-Gene in Enterobakterien in Europa sowie Nordamerika identifiziert. Quelle: AID Diagnostika

Analyse des Risikos durch Nachweis von plasmidischem AmpC
Neben den ESBL können auch AmpC-ß-Laktamasen (AmpC) zu Antibiotikaresistenzen führen. Diese Enzyme weisen eine Immunität gegen Penicilline, Cephalosporine (2. und 3. Generation) und Cephamycine auf. „Daher ermöglichen wir Anwendern mit einem weiteren Kit die Ermittlung der wichtigsten Mutationen im chromosomalen AmpC-Gen“, erklärt Preyer. „Die Gene für AmpC-ß-Laktamasen kommen bei einigen Bakteriengattungen natürlicherweise als chromosomale AmpC vor – beispielsweise bei Escherichia coli, bisher aber nicht bei Salmonellen. Sie werden jedoch nur unter bestimmten Bedingungen tatsächlich gebildet und wirksam.“

Besondere Aufmerksamkeit muss der steigenden Anzahl von sogenannten plasmidischen AmpC-Genen (pAmpC) gewidmet werden, die außerhalb des Chromosoms auf Plasmiden lokalisiert sind. „Sie sorgen ständig für die Bildung des entsprechenden Enzyms und liegen auf übertragbaren Genabschnitten“, so Preyer. „Unser Kit ermittelt die sechs plasmidischen AmpC ACC, ACT, DHA, FOX, LAT und MOX fehlerlos, die durch horizontalen Gentransfer sowohl zwischen Bakterien derselben oder auch unterschiedlicher Art ausgetauscht werden können.“ Diese umfassende Analyse ist sinnvoll, da auch harmlose Darmbakterien die Gene für AmpC an pathogene Erreger, beispielsweise Salmonellen, weitergeben können. Dem Anwender steht mit dem Verfahren ein verlässliches und effizientes Instrument zur Bestimmung von Resistenzmechanismen in Enterobakterien zur Verfügung, wodurch ein gezielter Einsatz von Antibiotika unter Berücksichtigung der festgestellten Resistenzen gewährleistet wird.