Ein HPLC-Tag in einem Entwicklungslabor kurz vor Weihnachten 2033...

Je nachdem nun, wie die gewünschte Auflösung erreicht werden kann, kommt entweder USLC ("Ultra Selectivity Liquid Chromatography2) oder UCLC ("Ultra Capacity Liquid Chromatography") ins Spiel. Einige wenige, aus der Distanz agierende Physikochemiker haben zwar richtigerweise darauf hingewiesen, dass es nicht immer Chromatographie sein muss und "Ultra" eher eine Marketing-Geschichte ist, und die Bezeichnung ARLT ("Adequate Resolution Liquid Techniques") vorgeschlagen. Aber solche Spezies sind in der Analytik bekanntlich in der Unterzahl und die Anwender wollten letztendlich "ihre" Chromatographie beibehalten. Da übrigens das Gerätedesign mit den diversen Kopplungstechniken so oder so oder eben so sein kann, hat man sich bezogen auf die Hardware auf den Terminus LSD ("Liquid Separation Device") geeinigt.

Betrachten wir jetzt zwei typische Fragenstellungen in einem Entwicklungslabor:

1. Analysieren einer/mehrerer neu synthetisierten Verbindung(en).

2. Substanz x bzw. Substanzen x, y und z_i-z_n in einer komplexen Matrix quantifizieren.

Der Ablauf sieht heute in etwa so aus:

• Folgende Informationen werden benötigt: Bezeichnung der Reaktanten und Nennung der Reaktionsbedingungen (Fall 1) bzw. der interessierenden Substanz(en) und der Matrixdaten (Fall 2). Bezüglich "Matrixdaten" im Fall 2 handelt es sich natürlich um alle zur Verfügung stehenden Infos, wie z.B: Patientendaten aus dem iPC ("inteligent Personal Chip"), wenn es sich um eine Humanprobe handelt, GPS-Daten der Entnahmestelle im Falle einer umweltrelevanten Probe bzw. den Code-Namen eines Lebensmittels, mit dem man sämtliche Daten vom Anbauort sowie Behandlung über die Lagerung bis hin zu den Transportbedingungen erfasst. Durch die heutige Erfassungsroutinen und die Vernetzungsdichte ist das Zusammentragen aller analytisch relevanten Daten mittlerweile ein Kinderspiel. Mit diesen Daten kann die kommerzielle oder eigene IAS ("Intelligent Analytical Software") nun selbstständig arbeiten. Anhand dieser Daten erfolgt zunächst mithilfe von Evolutionsalgorithmen und Wahrscheinlichkeitsrechnungen die Ermittlung der Analyte inkl. Struktur, die es entsprechend den Angaben zu quantifizieren gilt. Anschließend startet eine gezielte Meta-Suche nach geeigneten analytischen Methoden, einmal im klassischen WWW und einmal im spezifischen WFW ("World Friends Web"). Die Entwicklung und Verbreitung der WFWs seit Ende der 2020er Jahre hat stark zugenommen: Befreundete Unternehmen, Zweckbündnisse, Non-Profit-Organisationen, etc. schließen temporäre oder auch langfristig angelegte Wissensallianzen für die Generierung und Nutzung spezifischer Daten. Sollte in Worst-Case diese Suche nun zu keinen wirklich guten Ergebnissen führen, folgt Schritt zwei:
• Die Infos zu den Analyten, der errechneten Konzentrationen, der Matrix, etc. werden genutzt, um mögliche chromatographische Bedingungen und die daraus simulierten Chromatogramme zu ermitteln. (Die Bemühungen, die Anfang des Jahrtausends mit Chrom-Sword und den Snyder'schen Deskriptoren begannen, führten zu den heute ausgereiften und leistungsstarken Tools.)

Im Entwicklungslabor des Jahres 2033 stehen in der Regel folgende drei bis vier Systeme für generische Experimente zur Verfügung:

1. Spezifische, (bio)physikalische Bestimmungsmethoden, wie z. B: 2D-NMR, Ionenmobilität-MS, Biosensoren-Array, Intra-Molekül-Bindungs-Spektroskopie sowie immer häufiger diverse Kombinationen. Das ist der einfache und erwünschte Fall: Daten aus mehreren, spezifischen spektroskopischen Messungen plus bei Bedarf eventuell Daten aus dem biophysikalischen Bindungsverhalten führen nach einer chemometrischen Analyse zur gewünschten Information - eine chromatographische Trennung ist gar nicht nötig. Wenn die notwendige Information doch nur durch Trennung zu erhalten ist, kommt Möglichkeit 2 ins Spiel:

2.A: Für einfache Trennprobleme: Nach wie vor die alten, klassischen, eindimensionalen LSDs: Quarternäre (elektrogesteuerte) Gradientenpumpe mit 12-fachem Säulenschaltventil (entweder mit klassischen 10...20-mm-Säulen oder den langen, stabilen 50-mm-Säulen als "Arbeitspferd"), einer Optimierungssoftware und einem Splitter, damit das Eluat nach der optimierten Trennung im Auto-Modus je nachdem an DAD-MS/MS, ICP-MS, DAD- bzw. FLD-CAD bzw. DAD-ECD, usw. geleitet werden kann. Die Empfindlichkeit und die Robustheit dieser Systeme sind in der Zwischenzeit sprichwörtlich geworden.

2.B: Für komplexere Trenn-Probleme: Steckte die 2D-Chromatographie in den 2010er Jahre noch in den Kinderschuhen, ist sie heute für schwierige Fälle ein gut eingeführtes, längst bewährtes Tool. Neben den Klassikern wie z.B. NP-RP, RP-RP, IEC-SEC, HILIC-Mixed-Mode, etc., etc. werden immer mehr diverse Kombinationen getestet: SPE-LC-LC-GC, LC-CEC-DC, LC-ELISA, usw. Das heißt, man kombiniert mehrere mögliche Trennmodi mit den entsprechenden Einflussgrößen wie angelegte Spannung, unterschiedliche Wechselwirkungen, unterschiedliche Porengröße - also eine oder mehrere Trenntechnik(en) - und analytspezifische Reaktionen wie Farb- oder enzymatische Reaktionen. Es versteht sich von selbst, dass statt der Kombination chromatographiespezifische Bestimmung das Splitting mit nachfolgender spektroskopischer Untersuchung wie unter 2. A beschrieben nach wie vor den klassischen zweiten Schritt nach einer - wie auch immer
gearteten - (2D-)Trennung darstellt.

3. In Firmen bzw. Instituten mit dem entsprechenden Budget werden allerlei Hybrid-Systeme wie z. B. Röntgenfluoreszenz- bzw. CE-, CLC-, CEC-Ionenmobilität-MS eingesetzt, die allerdings eine untergeordnete Rolle spielen und hier lediglich erwähnt werden.

Jetzt "stehen" die infrage kommenden Methoden - entweder die gefundenen oder die anhand der Daten ermittelten. Je nach Bedarf "entscheidet" die IAS, was mit der Probe nun passieren soll: D.h., die Probe wird lediglich in den Verteilungsroboter gestellt und, je nachdem, für die Messung zu System 1 oder 2.A bzw. 2.B geführt. Bevor wir zur Auswertung/Bewertung kommen, sei an die Situation vor 8...10 Jahren erinnert: Die Umwelt- und Lebensmittelskandale in den Jahren 2018 bis ca. 2023 führten dazu, dass in vielen Bereichen der Gesellschaft schon ein Paradigmenwechsel stattgefunden hat. Eine der vielen Folgen war, dass seit dieser Zeit in der Analytik es tatsächlich um Qualität und Wahrheit geht. Der "Beweis" der Peakhomogenität oder der Identität eines Analyten mithilfe von DAD oder MS/MS gehört längst endgültig der Vergangenheit an. Diese frühe Praxis kann man sich heutzutage kaum vorstellen...

Nach den Läufen ergeben sich aus den erhaltenen Daten (k-Werte, α-Werte, Spektren, usw.) typische Zahlencluster (3-dimensionale Gebilde), die auf ein Fit mit den Daten aus der Recherche bzw. den simulierten Chromatogrammen geprüft werden. Je nach Übereinstimmung - entsprechend der Vorgaben des Analytikers - wird entschieden, ob weiterer analytischer Bedarf besteht oder eben nicht.

Trotz eines eventuell plausiblen Ergebnisses wird jenes jedoch heute fast immer mit einem zweiten, möglichst unterschiedlich designten Experiment geprüft. Das endgültige OK ist erst dann fällig, wenn - im Falle einer geplanten Implementierung in die Routine - die Robustheit inklusive Säulenstabilität überprüft worden sind. Erweist sich die Methode als nicht routinetauglich, wird sie entsprechend modifiziert oder es wird jene Methode getestet, die während der Testungsphase das zweitbeste Optimum gezeigt hat.

Zeitbedarf: Recherche ca. 2,5 h, eventuell Trennsimulation weitere 2,5 h, also ein Arbeitstag - wobei in dieser Zeit natürlich andere Aufgaben erledigt werden können. Nachts werden die automatisierten Experimente durchgeführt. Am zweiten Tag erfolgt kurz die Überprüfung der Geräte und die Sichtung der Ergebnisse, eventuell ist eine manuelle Arbeit notwendig (Chemikalien, Säulen). Bei Bedarf erfolgt das Starten von neuen Programmen (von IAS vorgeschlagen und vom User akzeptiert bzw. modifiziert) für weitere Bestätigungsexperimente in der darauffolgenden Nacht. Am dritten Tag schließt sich die Sichtung der Ergebnisse sowie Konsultationen mit Kollegen an. Damit ist die Arbeitswoche beendet, denn: Als eine der letzten haben die Pharma- und die Chemiebranche im Jahre 2025 die 4-Tage-Woche eingeführt, d.h. die üblichen drei Arbeitstage plus einen gesetzlich festgelegten Tag für die persönliche Weiterbildung.

Wenn wir pessimistisch sein wollten ...

• ...wird auch in 20 Jahren die Rede von "Performance" sein.
• ...wird bei der Methodenentwicklung und Optimierung systematisches Vorgehen weiterhin selten gelebt.
• ...werden technische Möglichkeiten nicht konsequent genutzt, analytische Techniken nicht intelligent kombiniert und somit die jeweiligen spezifischen analytischen Stärken nicht genutzt.
• ...bleiben Informationen weiterhin Informationen und werden mangels Zeit nicht zum Wissen.

...aber wir sind optimistisch und freuen uns auf die HRLC-Analytik des Jahres 2033 - aber vor allem und in erster Linie auf den nahenden Jahresausklang.

Ich wünsche Ihnen ein frohes, friedliches Fest und für 2014 Gesundheit und Zufriedenheit.

Ihr Stavros Kromidas
© by Stavros Kromidas
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