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Korrelative, konfokale Raman-Mikroskopie von Organismen und Biomolekülen

Imaging-SoftwareProbeninformationen in allen Dimensionen

Screenshot der Software Zeiss Zen Connect.

Intuitive Datenverwaltung, vereinfachte Workflows und verbesserte Einblicke in die Proben verspricht die Imaging-Software Zeiss Zen Connect.

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Chemie und Struktur im BildKorrelative, konfokale Raman-Mikroskopie von Organismen und Biomolekülen

Die Raman-Mikroskopie lässt sich in vielen Bereichen einsetzen und etabliert sich jetzt auch mehr und mehr in den Lebenswissenschaften und in der Pharmazie. 

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Topographisches Raman-Bild der Oberfläche einer Schmerztablette mit zugehörigen Spektren

Die konfokale Raman-Mikroskopie verbindet optische Mikroskopie mit Raman-Spektroskopie. Anhand der für jedes Molekül charakteristischen Vibrationsschwingungen lassen sich die Inhaltsstoffe einer Probe zerstörungsfrei identifizieren und ihre Verteilung mit hoher räumlicher Auflösung im Sub-Mikrometer-Bereich bildlich darstellen. Kombiniert man ein konfokales Raman-Mikroskop mit einem Rasterkraftmikroskop (AFM) oder einem Rasterelektronenmikroskop (SEM), ist es vergleichsweise einfach, die in der Probe enthaltenen Moleküle mit der Probenstruktur zu korrelieren. Raman-Mikroskopie lässt sich in vielen Bereichen einsetzen und etabliert sich jetzt auch in den Lebenswissenschaften und der Pharmazie.

RISE®-Bild von Hirngewebe eines Hamsters.

Hohe Informationsvielfalt
Als Raman-Effekt bezeichnet man die inelastische Streuung von Photonen an Materie, die einen Teil der Strahlungsenergie in Form von Vibrations- oder Rotationsenergie aufnimmt. Dies bewirkt eine Frequenzverschiebung der gestreuten Photonen. Diese Verschiebung ist charakteristisch für die Art und Koordination der beteiligten Moleküle, so dass sich aus den Spektren die molekulare Zusammensetzung der untersuchten Probe ermitteln lässt. Darüber hinaus liefern Raman-Spektren Informationen über die Quantität der enthaltenen Moleküle, über Stress im Material und zur Symmetrie und Orientierung von kristallinen Strukturen. Außerdem kann man Modifikationen kristalliner Substanzen identifizieren. So kommt beispielsweise Kalziumkarbonat in drei Modifikationen vor, von denen man zwei häufig in den Schalen und Panzern von Mollusken und Krebstieren findet und mit Raman-Mikroskopie lokalisieren kann [1]. Auch die Polymorphe pharmazeutisch wirksamer Substanzen kann man anhand ihrer Raman-Spektren voneinander unterscheiden.

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Ein konfokales Raman-Mikroskop besteht aus einem Laser, dem Mikroskop, einem Spektrometer, einer CCD-Kamera, die ein Spektrum im Rasterbetrieb an jedem Pixel der Probe aufzeichnet, sowie einer leistungsfähigen Software, die aus den Tausenden von aufgenommenen Spektren das Bild erzeugt. Die laterale Auflösung wird durch das Rayleigh-Kriterium begrenzt und liegt bei 0,61λ/NA (λ= Wellenlänge, NA = numerische Apertur). Eine 300 nm laterale Auflösung lässt sich erreichen. Damit empfindliche Proben geschont werden, sollte mit möglichst geringer Laserleistung gearbeitet werden. An den Raman-Mikroskopen von Witec kann man die Laserleistung absolut auf 0,1 mW genau messen und einstellen. 

Streulicht vermeiden, Lichtverlust verhindern
Raman-Streuung ist ein sehr schwacher Effekt, denn nur eines von einer Million eintreffende Photonen zeigt ihn. Daher sind eine hohe räumliche und spektrale Auflösung, eine besondere Empfindlichkeit der verwendeten Instrumente und deren Verbindungen zueinander sowie die Vermeidung von Streulicht und Signalverlust von entscheidender Bedeutung. Die Verbindung zwischen Mikroskop und Spektrometer wird am besten durch modernste optische Fasern verwirklicht, da sie die optischen Signale fast verlustfrei übertragen. Konfokalität sorgt dafür, dass Streulicht weitgehend ausgeblendet wird, so dass selbst schwache Raman-Streuer kontrastreiche Bilder liefern. Außerdem lassen sich damit dreidimensionale Bilder, Tiefen- und Volumenscans transparenter Proben erstellen.

Innerhalb des Spektrometers lassen sich Lichtverluste durch leistungsfähige optische Komponenten und hocheffiziente Gitter minimieren. Die spektrale Auflösung eines solchen Systems hängt von seiner Brennweite und der Liniendichte des Gitters ab. Je länger die fokale Länge des Spektrometers und je dichter die Linien des Gitters, desto besser ist die spektrale Auflösung. Die UHTS-Spektrometer von Witec haben eine Pixelauflösung von bis zu 0,1 Wellenzahlen. Auch die CCD-Kameras haben einen maßgeblichen Einfluss auf die Lichtausbeute und somit auf die Qualität der Bilder. Beste Ergebnisse erzielt man mit EM- (electron multiplying-) CCD-Kameras.

Einsatz in der Bio- und Pharmaanalytik
Immer häufiger wird die Raman-Mikroskopie zur Analyse biologischer Proben eingesetzt. Wasser stört die Messungen nicht. An ihren Raman-Spektren lassen sich zelluläre Inhaltsstoffe identifizieren und lokalisieren [2, 3]. Dabei lassen sich Substanzklassen wie Lipide, Nukleinsäuren und Proteine voneinander unterscheiden und Moleküle identifizieren [4]. Raman-Mikroskopie wurde eingesetzt, um den Aufbau von Gewebe wie arteriosklerotischer Plaques zu analysieren [5], Tumore exakt zu lokalisieren und von gesundem Gewebe zu unterscheiden [6] sowie um das Verhalten von Krebszellen auf die Behandlung mit Therapeutika zu verfolgen [7]. Konfokale Raman-Mikroskopie lässt sich selbst an Fluoreszenz-markierten Proben bewerkstelligen, obwohl die im Vergleich zum Raman-Signal extrem starke Fluoreszenz als „Feind“ der Raman- Mikroskopie gilt.

Auch für die Pharmaforschung ist die Raman-Mikroskopie eine interessante analytische Methode. Es wurde beispielsweise damit untersucht, wie sich Cremes und Salben auf der Haut verteilen und ob bzw. wie weit die darin enthaltenen Substanzen in die Haut eindringen [8, 9]. Zur Analyse von Arzneimittel-Abgabesystemen wie Tabletten eignet sich konfokale Raman-Mikroskopie ebenso. Damit lässt sich die Verteilung der Wirk- und Zusatzstoffe wie auch deren Freisetzung dokumentieren [10, 11]. Nicht nur glatte, sondern auch raue Oberflächen, wie sie viele nicht-lackierte Tabletten haben, können mit einem konfokalen Raman-Mikroskop untersucht werden, wenn das Gerät mit einem Profilometer ausgerüstet ist. Der von Witec entwickelte TrueSurface®-Sensor kontrolliert permanent den Abstand zwischen Objektiv und Probenstelle und hält diesen mit Sub-Mikrometer-Genauigkeit konstant. Damit können auch Veränderungen während Langzeitmessungen ausgeglichen werden. 

Durch Verknüpfung der Raman-Mikroskopie mit Techniken, die Strukturen auf der Oberfläche abbilden, lassen sich die chemische Zusammensetzung und die Morphologie einer Probe miteinander korrelieren. Am einfachsten gelingt dies, wenn man die Probe zwischen den verschiedenen Messungen nicht bewegen muss, sondern alle Aufnahmen am gleichen Gerät machen kann.

Das erste kombinierte Raman-AFM-Mikroskop wurde 2003 von Witec hergestellt. Bei diesem Mikroskop und seinen Nachfolgemodellen wechselt man zwischen den Mikroskopietechniken einfach durch Drehen des Objektivrevolvers. Das weltweit erste Arrangement von konfokalem Raman-Mikroskop und einem SEM in einem Gerät entwickelte Witec mit dem SEM-Hersteller Tescan (inzwischen gibt es auch Witec-Zeiss-Kombinationen). Bei dieser sogenannten korrelativen Rise®-(Raman Imaging Scan Electron-)Mikroskopie bleibt die Probe während sämtlicher Messungen innerhalb der Vakuumkammer. So gelingt es einfach, die hochaufgelösten SEM-Bilder mit den Raman-Bildern übereinander zu legen (s. Bild). 

Zusammenfassung
Die hier vorgestellten sowie viele andere, nicht genannten Beispiele dokumentieren eindrücklich, dass hochaufgelöste, konfokale Raman-Mikroskopie eine Technik ist, die in vielen Bereichen der Lebenswissenschaften und Pharmazie eingesetzt werden kann. Die nicht-invasive und markierungsfreie Methode ist bestens geeignet, Organismen, Zellen und Organellen zu analysieren, deren Inhaltsstoffe zu identifizieren und ihre Verteilung mit einer Auflösung im Sub-Mikrometerbereich im Bild darzustellen. Noch mehr Informationen liefert die korrelative Raman-Mikroskopie, wenn sie in Kombination mit Mikroskopietechniken verwendet wird, die Strukturen abbilden.

Autoren:  

Andrea Richter, Dr. Wolfram Ibach, Dr. Ute Schmidt, Dr. Karin Hollricher, Dr. Olaf Hollricher (Witec GmbH, Ulm)

Literatur

  1. L., Nehrke G., Brey, T. (2015), Confocal Raman microscopy in sclerochronology: A powerful tool to visualize environmental information in recent and fossil biogenic archives. Geochem Geophys Geosys 16, 325.
  2. J. et al. (2016), Raman spectroscopy as a sensitive probe of soft tissue composition – Imaging of cross-sections of various organs vs. single spectra of tissue homogenates. Trends in Analyt Chem 85, 117-127
  3. P. et al (2017), Label-free in vivo Raman microspectroscopic imaging of the macromolecular architecture of oocytes. Sci Rep 7, 8945
  4. A. et al. (2013), Raman spectroscopy of proteins: A review. J Raman Spectrosc 44, 1061.
  5. K.M. et al. (2014), Vizualisation of the biochemical markers of atherosclerotic plaque with the use of Raman, IR and AFM. J Biophotonics 7, 744.
  6. H., Brozek-Pluska, B. (2016), New look inside human breast ducts with Raman imaging. Anal Chim Acta 909, 91-100.
  7. Yosef H.K. et al (2015), In vitro prediction of the efficacy of moleculary targeted cancer therapy by Raman spectral imaging. Anal Bioanal Chem 407, 8321.
  8. Pyatski Y. et al. (2016), Effects of permeation enhancers of flufenamic acid delivery in Ex vivo human skin by confocal Raman microscopy. Int. J. Pharmac 505, 319.
  9. Sohn M., Buehler T., Imanidis, G. (2016), Repartition of oil miscible and water soluble UV filters in an applied sunscreen film determined by confocal Raman microspectroscopy. Photochem Photobiol Sci 15, 861.
  10. Smith G.P.S. et al. (2015), Raman imaging of drug delivery systems. Adv Drug Deliv Rev 89, 21
  11. Vukosavljevic B. et al. (2016), Novel insights into controlled drug release from coated pellets by confocal Raman microscopy. J Raman Spect 47, 757.



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