Spielen (fast) ohne Grenzen

Click-Chemie an Nukleinsäuren: vermeintlich simpel, hoch effektiv

Markierungsreaktionen von Nukleinsäuren haben längst Einzug in die Produktion z. B. von Diagnostika gehalten. Um das Anwendungsspektrum voll auszuschöpfen, gilt es Effizienz und Robustheit der Methode sicherzustellen. Hier kommt die Click-Chemie ins Spiel. 

© Shutterstock/phipatbig

Seit ihrer Entdeckung vor rund 20 Jahren haben die „Click-Chemie“ und ihre Anwendungen zahlreiche Labore erobert. Wie schon die Namensgebung andeutet, handelt es sich um eine Gruppe von Reaktionen, die extrem schnell und quantitativ ablaufen und einfach durchzuführen sind. Vom Erfinder Prof. Barry Sharpless wurde sie auch mit einem Verschlussprinzip ähnlich dem eines Sicherheitsgurts verglichen. Die Idee war, einige wenige sehr gute Reaktionen zur Verfügung zu haben, die möglichst einfach und breit angewendet werden können, anstatt eine riesige Anzahl an chemischen Reaktionen zur Auswahl zu haben, die – je nach Anwendung – neu optimiert werden müssen. 

Eine dieser Reaktionen, eine Kupfer-katalysierte Variante der Huisgen-Cycloaddition (CuAAC), verbindet hocheffizient zwei passend funktionalisierte Moleküle in wässriger oder organischer Lösung. Nur in Gegenwart entsprechender funktioneller Gruppen (Azid und terminales Alkin) und der katalytischen Kupferspezies kann die Reaktion ablaufen und lässt sich somit räumlich und zeitlich kontrollieren. Da es diese funktionellen Gruppen in Zellen nicht gibt, jedoch eine enorme Vielfalt an Alkin- oder Azid-modifizierten chemischen Bausteinen in vitro oder sogar in vivo eingebaut werden können, sind derartige bioorthogonale Markierungsexperimente möglich. Daher ist es nicht verwunderlich, dass dieses so einfache wie effiziente Prinzip im Bereich Life Science mittlerweile als Stand der Technik Einzug gehalten hat. Dabei sind der Phantasie fast keine Grenzen gesetzt.

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Detektion der Zellteilung 

Die Zellteilung ermöglicht es Lebewesen zu wachsen und zu regenerieren und ist daher von fundamentaler Bedeutung für das Leben. Bei höheren Organismen, z. B. bei Säugetieren, geht der eigentlichen Zellteilung eine Teilung des Zellkerns voraus, wofür die genetische Information in Form von DNA zunächst dupliziert werden muss. Die Fähigkeit der Zelle die DNA zu replizieren kann Aufschluss über eine ganze Reihe von Prozessen geben, u. a. ob eine der Zellkultur zugefügte Substanz giftig für die Zelle ist und die Zellteilung hemmt. Dies kann im Falle von Krebszellen ein gewünschter Effekt sein, stellt aber für die Verwendung in Lebensmitteln oder Kosmetika ein klares Ausschlusskriterium dar.

Ein Click – zahlreiche Anwendungsmöglichkeiten. © Baseclick

Durch Verfütterung eines Alkin-modifizierten DNA-Bausteins, dem EdU (kurz für Ethynyl Desoxyuridin), das von den Zellen aufgenommen und während der DNA-Synthese eingebaut wird, lässt sich die Alkinkomponente für die nachfolgende Detektionsreaktion einführen. Durch Click-Reaktion mit z. B. fluoreszierenden Farbstoffaziden können diese Zellen dann mit Hilfe von Fluoreszenzmikroskopie oder Fluoreszenz-basierter Zellsortierung (FACS) bzw. im Hochdurchsatz analysiert werden. Der Vorteil: Die Verwendung von radioaktiven Substanzen oder langwierigen und weniger sensitiven Prozeduren über Antikörpernachweise, wie in bisherigen Verfahren, wird durch diese EdU-basierte Methode überflüssig. Dies ermöglicht es sicher, schnell und effektiv auf die Teilungsfähigkeit der Zellen im Untersuchungszeitraum zu schließen und dadurch z. B. geeignete Substanzen für die Krebstherapie zu identifizieren.

Aptamere – DNA-Antikörper

Antikörper helfen dem Körper sich gegen Krankheitserreger zu wehren und sind eine wichtige Medikamentengruppe geworden. Darüber hinaus werden sie bei der spezifischen Detektion bestimmter Proteine in der Diagnostik und bei der Visualisierung von Zellbestandteilen eingesetzt. Seit einiger Zeit werden Aptamere – DNA- oder RNA-Oligonukleotide mit spezifischen Bindeeigenschaften – daraufhin untersucht, in wieweit sie Aufgaben der Antikörper übernehmen und verbessern können. Der große Vorteil der Aptamere liegt darin, dass es zunehmend möglich wird deren Selektion und Synthese automatisiert durchzuführen und dabei Zeit, Geld und v. a. Tiermodelle zu sparen. Einige Hindernisse, wie z. B. die geringe Erfolgsrate beim Finden von geeigneten Aptameren für eine Zielstruktur, haben diese Entwicklung verzögert. Jedoch gibt es erste Hinweise bei unseren Partnern, dass die im sogenannten Click-Selex-Prozess verwendete Click-Chemie das Potenzial hat die Aptamerentwicklung nachhaltig zu prägen. Denn durch Zugabe eines Alkin-modifizierten Bausteins während der PCR und anschließendem Click mit funktionalisierten Aziden lässt sich die chemische Vielfalt der resultierenden potenziellen Aptamere und damit die potenziellen Bindeziele im Vergleich zur Verwendung ausschließlich natürlicher Nukleotide bereits deutlich erhöhen.

mRNA-Konjugate 

Die mRNA ist die Arbeitskopie der Zelle, mit deren Information benötigte Proteine hergestellt werden. Aufgrund von technologischen Entwicklungen der letzten Jahre wird es immer wahrscheinlicher, dass künstlich hergestellte mRNAs das Potenzial haben neuartige Therapiemöglichkeiten zur Behandlung von Krankheiten zu bieten. Jedoch stellen die Eigenschaften der mRNA, ihre enorme Größe und Ladung, eine große Herausforderung dar. Auch die Tatsache, dass mRNAs normalerweise innerhalb weniger Minuten außerhalb und innerhalb von Zellen abgebaut werden, erschwert deren Verwendung. Die bisherigen Lösungen für diese Herausforderungen basieren auf optimiertem Sequenzdesign, der Verwendung von polykationischen Transfektionsreagenzien und dem Einbau von modifizierten Nukleotiden während der mRNA-Herstellung.

Aufgrund der Komplexität der Moleküle sind chemische Modifikationen und die Herstellung von Konjugaten, für z. B. eine gewebespezifische Aufnahme der mRNA, noch weitgehend unbekannt. Die Click-Chemie bietet die idealen Voraussetzungen mRNAs leicht und effizient chemisch zu modifizieren. Denn nach dem Einbau von „clickbaren“ Gruppen ist einer „Dekoration“ der mRNA mit einer Vielzahl an Reportermolekülen, Stabilisierungsreagenzien oder aber auch Target-spezifischen Einheiten Tür und Tor geöffnet. Dies könnte den Durchbruch für eine breite Verwendung der RNA-Technologie in der Therapie bedeuten.

Sequenzierung

Die Sequenzierung von Nukleinsäuren, insbesondere die sogenannten „Next-Generation-Sequencing“ (NGS)-Methoden, gelten als die Zukunftstechnologie in der Diagnostik. Für eine breite Anwendung von Sequenzierung für individualisierte Therapieansätze z. B. in der Krebstherapie ist es notwendig die Effizienz und den Durchsatz der Methoden weiter zu steigern und dadurch die Kosten zu senken. Die meisten derzeitigen Sequenziermethoden basieren auf einem Prinzip, bei dem die Abfolge der Basen während des enzymatischen Einbaus von markierten Nukleotiden bestimmt wird. Bei einigen dieser Methoden ist es sogar möglich die Synthese eines einzelnen DNA Stranges in Echtzeit zu beobachten. Damit so etwas überhaupt funktioniert, müssen die Signale des Nukleotideinbaus deutlich vom Hintergrund zu unterscheiden sein, und die Nukleotide müssen höchsten Qualitätsansprüchen genügen. Dafür werden jetzt schon Fluorophor-markierte Nukleotide benötigt, die mit Hilfe von Click-Chemie hergestellt werden. Dies kann durch die Modularität (vier verschieden markierte Nukleotide können nach demselbem Prinzip erzeugt werden), der hohen Effizienz und der hohen Ausbeute ermöglicht werden, so dass hochkomplexe Nukleotide mit Mehrfach-Markierung erzeugt werden können. Mit alternativen Protokollen ist dies gar nicht oder nur mit wesentlich größerem Aufwand zu erreichen. Zudem wird gerade auch der Einsatz der Click-Chemie bei der Optimierung von Probenvorbereitungen sowie der Chipbeladung im Bereich der NGS erforscht. 

Fazit 

Die hier beispielhaft vorgestellten Anwendungen der Click-Chemie lassen das enorme Potenzial hinter dieser vermeintlich simplen Reaktion bereits erahnen. Die Anwendungen v. a. für den Bereich „Personalisierte Medizin“ scheinen sehr vielversprechend zu sein. Wir sind davon überzeugt, dass sich das Anwendungsspektrum in den nächsten Jahren rasant erweitern wird und verfolgen gespannt die Entwicklung unserer geschützten Technologie.


AUTOREN

Dr. Sascha Serdjukow
Dr. Jessica Sobotta
Dr. Thomas Frischmuth
Dr. Birgit Graf 

Baseclick GmbH, Neuried

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