SFR Shake Flask Reader

ATP-Synthese über oxidative Phosphorylierung Messung des Sauerstoffverbrauchs mittels SFR Shake Flask Reader

Eine F1F0-ATP-Synthase-Deletionsmutante von Corynebacterium glutamicum wurden hinsichtlich des Wachstums, der Nebenproduktbildung und Bioenergetik untersucht und charakterisiert. Mit Acetat als einziger Kohlenstoffquelle konnte die ∆F1FO-Mutante nicht wachsen, erreichte aber 47 % der Wachstumsrate und 65 % der Biomasse des Wildtyps, wenn sie in Schüttelkolben mit Glucose als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle kultiviert wurde. Der im Medium gelöste Sauerstoff (dissolved oxygen, DO) wurde online und nicht-invasiv mit dem SFR Shake Flask Reader überwacht, um den Sauerstoffverbrauch des Wildtyps und der ∆F1FO-Mutante mit Analysenergebnissen für andere Parameter zu vergleichen.

Die SFR-Messungen machten den Grund für die zweiphasige Glucoseaufnahme der Mutante deutlich: Wenn Sauerstoff limitierend wurde, reduzierte sich die Glucose-Aufnahmerate der Mutante weit unter die des Wildtyps. Die Ergebnisse zeigen, dass die F1F0-ATP-Synthase und oxidative Phosphorylierung nicht für das Wachstum von C. glutamicum essenziell sind, wenn die Kohlenstoffquelle Substratstufenphosphorylierung erlaubt.

C. glutamicum ist der wichtigste Mikroorganismus für die groß angelegte biotechnologische Produktion von L-Glutamat und L-Lysin, und dient gleichzeitig als Modellorganismus für verschiedene verwandte humanpathogene Mikroorganismen, wie etwa Mycobacterium tuberculosis.

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Daher wird der Stoffwechsel dieses Bakteriums sehr genau untersucht.

Die meisten aeroben Bakterien synthetisieren ATP sowohl über Substratstufenphosphorylierung (SSP) als auch über oxidative Phosphorylierung oder allgemeiner über die Elektronentransportphosphorylierung (ETP). In dieser Studie wurde die Rolle der ATP-Synthese über ETP in C. glutamicum genauer untersucht. In der ETP synthetisieren Mikroorganismen ATP mit Hilfe der membrangebundenen F1F0-ATP-Synthase, welche einen elektrochemischen Protonengradienten als treibende Kraft benötigt. Obwohl allgemein angenommen wird, dass C. glutamicum den Großteil des ATP über ETP synthetisiert, wurden dennoch kaum Untersuchungen zur F1F0-ATP-Synthase durchgeführt. Daher wurde in dieser Studie eine Mutante von C. glutamicum ATCC 13032, der alle für die F1F0-ATP-Synthase kodierenden Gene fehlten (∆ F1F0) genauer untersucht. Die Stämme wurden in Schüttelkolben mit integrierten chemisch-optischen Sensoren kultiviert, so dass nicht-invasive Online-Messungen des Gehalts an gelöstem Sauerstoff mittels des SFR Shake Flask Readers von PreSens durchgeführt werden konnten. Der Sauerstoffverbrauch durch die ∆F1F0-Mutante und des Wildtyps konnten so während der ganzen Kultivierungsdauer gemessen und später mit Analysenergebnissen für andere Parameter verglichen werden.

Material & Methoden
C. glutamicum-Stämme und Plasmide sowie die Vorkulturbedingungen sind in [1] aufgelistet und beschrieben. Die Stämme wurden in 500-ml-Erlenmeyerkolben mit Schikanen und einem Septum für sterile Probennahme kultiviert, die 50 ml Minimalmedium mit 4 % (w/v) Glucose enthielten und bei 30 °C und 130 min–1

inkubiert wurden. Die Abnahme des Gelöstsauerstoffs (dissolved oxygen, DO) wurde mit dem SFR Shake Flask Reader (PreSens) bestimmt, mit dem nicht-invasive Messungen mit autoklavierbaren, chemisch-optischen Sensoren gemacht werden können. Diese Sensoren sind in den Schüttelkolben integriert (Bild 1) und werden durch die transparente Wand des Kolbens mit dem SFR ausgelesen. DO wurde in %-Luftsättigung in einem Intervall von 10 min über die ganze Kultivierungsdauer gemessen. Die Methoden zur Bestimmung der Wachstumsrate, der Biomasse, der Glucosekonzentration, aber auch von organischen Säuren werden detailliert in [1] beschrieben. Die spezifische Glucoseaufnahmerate (sGUR) wurde mit folgender Formel berechnet:

Dabei ist cglc die Glucosekonzentration in (g l-1), XTZ das Zelltrockengewicht (TZ) pro Volumen (g l-1) und (ti+1– ti) das untersuchte Zeitintervall.

Ergebnisse
Es wurden Vorversuche auf CGXII-Minimalmedium-Agarplatten durchgeführt, die entweder 222 mM Glucose oder 100 mM Acetat als alleinige Kohlenstoffquelle enthielten. Es stellte sich heraus, dass die ∆F1F0-Mutante mit Glucose als einziger Kohlenstoffquelle wachsen konnte, wenn auch langsamer als der Wildtyp, aber kein Wachstum auf Acetat zeigte. Im Gegensatz zu Glucose erlaubt der Acetatstoffwechsel in einer ATP-Synthase-Mutante keine Netto-ATP-Synthese über SSP.

In Schüttelkolben mit CGXII-Minimalmedium und mit 4 % (w/v) Glucose als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle zeigte die ∆F1F0-Mutante im Vergleich zum Wildtyp eine um 47% reduzierte Wachstumsrate (0,19 ± 0,02 h-1 im Gegensatz zu 0,40 ± 0,01 h-1) und erreichte schließlich 65 % der Biomasse des Wildtyps (10,3 ± 0,5 g (TZ) l-1 im Vergleich zu 15,8 ± 3 g (TZ) l -1), wie in Bild 2 A dargestellt ist. Diese Ergebnisse zeigen, dass die F1F0-ATP-Synthase nicht essenziell für das Wachstum von C. glutamaticum ist, wenn der Mikroorganismus mit Substraten kultiviert wird, die Netto-ATP-Synthese über SSP zulassen. Der Wildtyp zeigte eine kontinuiuerliche Glucoseaufnahme, bis diese nach 24 h aufgebraucht war (Bild 2 B).

Die Kinetik der Glucoseaufnahme der ∆F 1F0-Mutante dagegen zeigte deutlich zwei Phasen mit einer Veränderung nach 5...11 h, und die Glucose war nach 30 h verbraucht. Innerhalb der ersten Stunden der Kultivierung erreichte die errechnete sGUR der Mutante Werte von ≥328 ± 72 nmol min-1(mg TZ)-1, die etwa dreimal so hoch waren wie der des Wildtyps mit sGUR ≥89 ± 1 nmol min-1(mg TZ)-1. In der zweiten Phase lag die sGUR der Mutante in einem Bereich von 21 ± 16 nmol min-1(mg TZ)-1, also viel niedriger als die des Wildtyps. Um eine Erklärung für die biphasische Glucoseaufnahme der Mutante zu finden, wurde der Sauerstoffverbrauch mit dem SFR bestimmt. Von Beginn an verbrauchte die ∆F1F0-Mutante Sauerstoff schneller als der Wildtyp (Bild 3A), während sie gleichzeitig eine langsamere Wachstumsrate aufwies, so dass man eine erhöhte Atmungsrate annehmen kann. Nach 7...8 h fiel die Konzentration von gelöstem Sauerstoff in der Mutantenkultur gegen null. Der Zeitpunkt des Sauerstoffmangels korrelierte mit der Verringerung der Glucoseaufnahmerate. Somit löste die Verfügbarkeit des finalen Elektronenakzeptors Sauerstoff den Wechsel im Glucosestoffwechsel der Mutante aus.

Der beschleunigte Glucoseverbrauch der ∆F1F0-Mutante wurde von Beginn der Kultivierung an durch die Sekretion von Pyruvat in den Kulturüberstand begleitet (Bild 3B), wobei keine anderen organischen Säuren nachgewiesen werden konnten. Nach 8 h, als Sauerstoff limitierend und die Glucoseaufnahmerate reduziert wurde, wurde Pyruvat wieder verstoffwechselt. Im Gegensatz zur ∆F1F0-Mutante schied der Wildtyp kein Pyruvat aus.

Zusammenfassung
Untersuchungen einer Mutante von C. glutamicum, die keine ATP-Synthese über oxidative Phosphorylierung betreiben kann, zeigten, dass der Mikroorganismus auf Substraten, die SLP erlauben wie Glucose, wachsen konnte. Dies belegt, dass die F1F0-ATP-Synthase im Allgemeinen nicht essenziell für den Mikroorganismus ist.

Der Glucosestoffwechsel der Mutante zeigte zwei deutliche Phasen in Abhängigkeit von der Verfügbarkeit des finalen Elektronenakzeptors Sauerstoff. Nichtinvasive Online-Überwachung des gelösten Sauerstoffs mit dem SFR erleichterte es, die Kohlenstoffaufnahme mit der Sauerstoffaufnahme der Mutante und des Wildtyps zu vergleichen. Das SFR erwies sich dabei als leicht zu handhabendes und zeitsparendes Werkzeug, das es möglich machte, wichtige Einblicke in den Stoffwechsel der Mutante zu erlangen.

Literatur
[1]Koch-Koerfges, A. Kabus, I. Ochrombel, K. Marin, M. Bott, 2012, Pyhsiology and global gene expression of a Corynebacterium glutamicum ∆F1FO-ATP synthase mutant devoid of oxidative phosphorylation, Biochimica et Bioshysica Acta 1817, pp. 370–380.

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