Reinstwassersystem arium

Reinstwasser für die HPLC

Die HPLC ist ein analytisches Verfahren zur Trennung, Identifizierung und Quantifizierung von Substanzen mittels Flüssigkeitschromatographie. Die Anfänge der HPLC, High Pressure Liquid Chromatography (Hochdruck(flüssigkeits)chromatographie) gehen auf die 60er Jahre zurück. Dank verbesserter Säulenmaterialien und Geräte ist seit Ende der 70er Jahre die Rede von High Performance Liquid Chromatography (Hochleistungs(flüssigkeits)chromatographie) [1].

Bei der HPLC wird das zu trennende Gemisch mit Hilfe eines Lösungsmittels (Elutionsmittel) oder Lösemittelgemisches (Eluent/Mobile Phase) mittels eines Injektors und Pumpe zur Trennsäule gebracht, die meist ein Stahlrohr aus rostfreiem Edelstahl ist, das mit der sogenannten stationären Phase gefüllt ist (vergleiche Bild 1). Die stationäre Phase besteht meistens aus porösen Kieselgel- oder Polymerpartikeln, auf deren Oberfläche chemische Liganden gebunden sind. Diese Liganden sind für die selektiven Wechselwirkungen der Analyten mit der stationären Phase verantwortlich, die für eine effektive chromatographische Trennung nötig sind. Als Trennmechanismen kommen, abhängig von Probe und stationärer Phase, z.B. Adsorption durch Van-der-Waals-Kräfte, Ionenaustausch, Ionenausschluss, usw. in Frage. Die Probensubstanzen werden bei der Auftrennung unterschiedlich lang am Säulenmaterial festgehalten (reteniert) und verlassen die Säule daher nach unterschiedlichen Zeiten. Die einzelnen Probenkomponenten werden anschließend vom Detektor registriert und in einem Computer ausgewertet. Das Ergebnis ist ein Chromatogramm (Bild 1); die Anzahl der Peaks entspricht der Anzahl der aufgetrennten Probenkomponenten, die Fläche ist deren Menge proportional (in Anlehnung an Kromidas 2000 [1]).

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Zu einer typischen HPLC-Anwendung zählt die Zuckeranalytik. Diese wurde im Rahmen verschiedener Versuche zur Charakterisierung der Qualität von Mem-branen durchgeführt. Einerseits wurde eine Abreicherung von Zuckern mit Membranen getestet, andererseits wurde die Aktivität von Enzym-immobilisierten Membranen bestimmt. Dazu mussten Zucker wie Raffinose, Glucose und Fructose bestimmt werden.

Zum spezifischen Nachweis der Zucker können enzymatische Methoden eingesetzt werden (z.B. GOD/POD-Bestimmung für Glucose [2]) oder spektroskopische Methoden (z.B. Bestimmung von Fructose nach Dische & Borenfreund [3]).

In der modernen Analytik werden Zucker heute häufig mittels Dünnschichtchromatographie (DC), Gaschromatographie (GC) und Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) bestimmt. Diese Verfahren kommen insbesondere dort zur Anwendung, wo Gemische mehrerer Zucker zu trennen sind [4].

Bei der HPLC, wie hier beschrieben, muss das Laufmittel physikalisch und chemisch besonders rein sein, darf weder mechanische Schwebstoffe oder Partikel, noch gelöste Substanzen enthalten, die von der Säule verzögert freigesetzt werden und damit ein Signal geben. Die Qualität eines Lösemittels entscheidet oftmals über die Zuverlässigkeit einer HPLC-Analyse. Das Vorhandensein von Spurenverunreinigungen in der Gradientenelution kann zu "Geister- oder Phantompeaks" führen. Diese Spurensubstanzen werden beim Analysenlauf in der Säule angereichert und treten beim nachfolgenden Elutionswechsel verstärkt aus der Säule aus.

Das verwendete Laufmittel Wasser muss keimfrei sein. Es kann dazu mit solchen Stoffen (z.B. Kupfersalze, Natriumazid) versetzt werden, die einer Verkeimung oder Veralgung des Laufmittels vorbeugen [5]. Hierbei sind die jeweiligen Empfehlungen des Säulenherstellers zu beachten, da die Verwendung der falschen Zusätze zu irreversiblen Beschädigungen der Säule führen können.

Entsalztes oder destilliertes Wasser enthält noch erhebliche Mengen an organischen Substanzen, die Geisterpeaks verursachen können [5]. Verunreinigtes Laufmittel kann zu Ablagerungen auf der stationären Phase und damit zu Verblockungen führen, was sich in einem Druckanstieg und einer Laufzeitverschiebung der Proben äußern würde.

Laufmittel Wasser mit arium® pro VF herstellen
Wasser, speziell zur HPLC mit entsprechender Qualität, kann bei diversen Herstellern gekauft oder aber durch ein Wasseraufbereitungssystem wie dem arium® pro VF direkt vor Ort und nach Bedarf hergestellt werden. Im Folgenden werden Versuche zur Auftrennung von Zuckergemischen beschrieben, bei denen Reinstwasser, hergestellt mit dem arium® pro VF, als mobile Phase (Laufmittel) diente.

Das arium® pro VF System (Bild 2) wurde zur Herstellung von Reinstwasser aus vorbehandelten Trinkwasser konzipiert und entfernt aus diesem noch vorhandene Verunreinigungen. Die Reinstwasserproduktion erfordert kontinuierliche Rezirkulation des Reinstwassers im System und einen konstanten Wasserfluss, was durch ein Pumpensystem mit Druckregelung erreicht wird. Die Leitfähigkeit des Wassers wird am Speisewasser-Einlass und im Produktwasser (am Wasser-Auslass) gemessen.

Das bei den hier dargestellten Untersuchungen verwendete System arium® pro VF (Vorgängergerät mit gleichen technischen Spezifikationen wie das abgebildete, redesignte System) arbeitet mit zwei unterschiedlichen Kartuschen. Diese sind mit einem speziellen Aktivkohle-Adsorber und Mischbett-Ionenaustauscherharzen gefüllt, um hochreines Wasser mit einem geringen TOC-Gehalt zu liefern. Weiterhin ist eine UV-Lampe integriert, die bei den Wellenlängen 185 nm und 254 nm oxidierend und keimtötend wirkt.

Beim arium® pro VF System ist außerdem ein Ultrafilter-Modul eingebaut, das als Crossflow-Filter betrieben wird. Die verwendete Ultrafiltrationsmembran hält Kolloide, Mikroorganismen, Endotoxine, RNA und DNA zurück.

Ein 0,2 µm-Endfilter ist am Wasserauslass installiert und dient der Entfernung von Partikeln und Bakterien aus dem erzeugten Reinstwasser während der Dosierung. Der Prozess der gerätspezifischen Wasseraufbereitung ist in Bild 3 (Fluss-diagramm arium® pro VF) dargestellt.

Materialien und Methode
Die Analytik der Proben erfolgte an einer HPLC Agilent 1200 series (Bild 4 und Tabelle 1) mit einer Rezex RNM Carbohydrate Na+ 8% HPLC-Säule der Firma Phenomenex [6]. Diese Säule ist gefüllt mit einem quervernetzten Polystyrol-divinylbenzol-Copolymer, das mit Natriumsulfonatgruppen modifiziert ist. Dieses Material nutzt den Ionenausschluss-Mechanismus. Das bedeutet, dass die Analyten nach unterschiedlichen ionischen Wechselwirkungen aufgetrennt werden. Durch die Sulfonatgruppen auf der Oberfläche des Materials sind die Poren negativ geladen, was dazu führt, dass die negativ geladenen Moleküle nicht in die Poren des Materials eindringen können und dadurch schneller eluieren. Dieser Ausschluss basiert auf dem Gibbs-Donnan-Gleichgewicht für Ionen an Membranen. Die Analyten, die in die Poren eindringen können, werden anschließend, basierend auf sterischen Unterschieden sowie hydrophoben und polaren Wechselwirkungen, mit den funktionellen Gruppen auf der Oberfläche der stationären Phase getrennt. (Ausführlichere Informationen zu dem hier beschriebenen Trennmechanismus siehe [7]).

Die Retentionszeiten der verschiedenen Zucker wurden durch die Aufnahme des Brechungsindex-(RI-)Signals bestimmt. Das RI-Signal wird in einer dimensionslosen Zahl in nRIU (nano Refractive Index Unit) angegeben und gibt die Differenz des Brechungsindex der Probe in der Probenzelle zur mobilen Phase in der Referenzzelle an.

Als mobile Phase wurde Reinstwasser verwendet, welches mit dem arium® pro VF System hergestellt wurde. Das Reinstwasser wurde zur Entgasung über ein Sartolab BT 500 bottle top filter 0,2 µm (Sartorius Sartolab BT 180C5) per Vakuum filtriert.

Durchführung der HPLC-Analyse
Zur Vorbereitung der Analysen wurde die Rezex-Säule im Säulenofen auf 75 °C temperiert und über Nacht mit arium® pro VF Reinstwasser mit 0,6 ml/min gespült. Die optische Einheit des RI-Detektors wurde auf 35 °C temperiert. Die zu untersuchenden Proben wurden in arium® pro VF Reinstwasser angesetzt und über einen 0,2 µm-Spritzenvorsatzfilter (Sartorius Minisart® RC4 17822) vorfiltriert. Die HPLC-Analytik der Proben erfolgte nach festgelegten Parametern einer erstellten Methode für die HPLC [6] (Tabelle 2 auf Seite 24).

Ergebnisse
Zur Bestimmung der Retentionszeiten der einzelnen Zucker (Tabelle 3) wurden diese einzeln angesetzt und injiziert (Bild 5). Da die Zucker unterschiedlich starke Wechselwirkungen mit der stationären Phase eingehen, werden für jeden Zucker nach dem Durchlaufen der Säule spezifische Retentionszeiten mit dem RI-Detektor aufgenommen.

Nach der Bestimmung der einzelnen Zucker wurde ein Zuckergemisch hergestellt und aufgetrennt (Bild 5).

Die einzelnen Zucker wurden voneinander getrennt. Die Peaks zu den unterschiedlichen Retentionszeiten können den zuvor einzeln bestimmten Zuckern zugeordnet werden.

Die Auswirkung von Verunreinigungen bzw. der Einfluss von Salzen wurde durch Injektion von Leitungswasser und Kaliumphosphatpuffer nachgestellt (Bild 6).

Eine Injektion von Leitungswasser (Leitfähigkeit 265 µS/cm) und Kaliumphosphatpuffer (Leitfähigkeit 1700 µS/cm) zeigt deutliche Signale und kann somit eindeutig als Verunreinigung erkannt werden.

Gerade mehrfach geladene Ionen aus dem Leitungswasser werden leicht durch die Sulfonatgruppen gebunden. Durch das dadurch veränderte Dissoziationsgleichgewicht können auch die Retentionszeiten der jeweiligen Zucker beeinflusst werden. Für eine sichere HPLC-Analyse mit stabilen Retentionszeiten und Vermeidung von Geisterpeaks muss daher die mobile Phase frei von Salzen oder anderen Verunreinigungen sein. Das hier eingesetzte Reinstwasser hat eine Leitfähigkeit von 0,055 µS/cm und ist weitestgehend frei von störenden Verunreinigungen, was sich in einer geraden Basislinie ohne Peakspitzen äußert (grüne Basislinie in Bild 6).

Der Säulendruck während der Läufe betrug gleichbleibend 23 bar. Dies zeigt, dass es keine Ablagerungen auf der Säule gab. Blank-run-Läufe zu Beginn und am Ende zeigten keine Veränderungen, d.h. es gibt keine Verunreinigungen der mobilen Phase.

Zur Bestimmung der Reproduzierbarkeit und der Nachweisgrenze wurden Standardreihen mit unterschiedlichen Konzentrationen analysiert. Als Beispiel ist hier Raffinose aufgeführt. Die Retentionszeiten und die Peakflächen der Peaks wurden aufgenommen und sind tabellarisch aufgeführt (Tabelle 4).

Die wiederholt erhaltenen gleichen Retentionszeiten zeigen eine sehr gute Reproduzierbarkeit. Die Raffinose-Standardreihe zeigt bis zu einer Konzentration von 0,015 mg/ml einen linearen Verlauf (Bild 7). Die Erstellung einer Standardgeraden an Hand der Peakflächen lässt eine Quantifizierung von Proben, in diesem Fall Raffinose, mit unbekannter Konzentration zu.

Schlussfolgerung
Die hier beschriebenen Ergebnisse zeigen, dass das vom arium® pro VF erzeugte Reinstwasser problemlos für die hier verwendete Zuckeranalytik als mobile Phase bei der HPLC-Analyse eingesetzt werden kann.

Die Wechselwirkungen der Probe mit der stationären Phase werden nicht durch die mobile Phase beeinflusst, da das erzeugte Reinstwasser mit einer Leitfähigkeit von 0,055 µS/cm als nahezu frei von Verunreinigungen angesehen werden kann.

Es entstehen keine Geister- oder Phantompeaks durch Salze [5]. Außerdem lassen die Versuche darauf schließen, dass keine Ablagerungen auf der stationären Phase durch Verunreinigungen auftreten, was sich in einem Druckanstieg und einer Laufzeitverschiebung der Proben äußern würde.

Damit bietet das jederzeit frisch herstellbare arium® pro VF Reinstwasser eine preiswerte Alternative zu käuflichem Reinstwasser zur Herstellung von hochreinen Laufmitteln für die HPLC-Analysentechnik, wie sie bei der Lebensmittelanalytik, Umweltanalytik sowie in der medizinischen-, chemischen- und biochemischen Forschung und auch während Prozesskontrollen der pharmazeutischen/biotechnologischen Industrie eingesetzt wird.

Die hier durchgeführten Arbeiten und die dabei gemachten sehr guten Erfahrungen hinsichtlich der Nutzbarkeit von arium® pro VF Reinstwasser als mobile Phase bei der HPLC sollen in nächster Zukunft auf andere Trenntechniken wie zum Beispiel die Reversed Phase Chromatography, die Size Exclusion Chromatography oder die UHPLC ausgedehnt werden.

Literatur

  1. Stavros: HPLC für Neueinsteiger, aus dem Internet, © by Novia GmbH, (2000).
  2. Ulrich Bergmeyer, Methoden der enzymatischen Analyse Band II, Verlag Chemie, Seite 1179,1180 (1970).
  3. Z. and Borenfreund, E.: A New Spektrophotometric Method for the Detection of Keto Sugars and Trioses, J. Biol. Chem. 192, 583-587, (1951).
  4. Heft 10, Seite 7, LCI-Focus, (2006).
  5. W.: RP-HPLC für Anwender. Reihe: Die Praxis der instrumentellen Analytik, Herausgeber Gruber, U. und Klein, W., VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Seite 7-8 (1993).
  6. Product Guide 12/13, Phenomenex, pages 232-233, (2012).
  7. Joachim: Ionenchromatographie, Wiley-VCH Verlag, Weinheim, Kapitel 5, Seiten 349 ff. (2001).

Danksagung
Der Firma Phenomenex, Aschaffenburg, sei an dieser Stelle für die freundliche Überlassung der Rezex RNM Carbohydrate Säule gedankt.

Autoren

Katrin Töppner
Sartorius Stedim Biotech GmbH, 37079 Göttingen.
Dr. Dirk Hansen, Ltd., 63741 Aschaffenburg.
Dr. Elmar Herbig, Sartorius  AG, 37075 Göttingen, E-Mail: elmar.herbig@sartorius.com.

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