SEC-MALS erhöht Patientensicherheit

Analyse von Antikörper-Wirkstoff-Konjugaten

Konjugate aus monoklonalen Antikörpern und (zytotoxischen) Wirkstoffen (ADCs: Antibody Drug Conjugates) werden heute bei Krebserkrankungen bereits eingesetzt, und etliche davon sind bei den pharmazeutischen Firmen in der „Pipeline“.

Bild 1: Die Molekülgewichte zweier unterschiedlicher ADC-Formulierungen wurden mittels SEC-MALS gemessen.

Das Wirkprinzip ist ebenso einfach wie genial und erinnert an das Trojanische Pferd aus der Sage des klassischen Altertums. Ein mit zytotoxischen Wirkstoffen wie beispielsweise Auristatin oder Maytansinoid gekoppelter Antikörper dockt dank seiner hohen Spezifität zielgenau an der Oberfläche ganz bestimmter Tumorzellen an. Sodann erfolgt – oft im Zuge einer Konformationsänderung des Antikörperproteins – die Freisetzung der Toxine. Diese können dann ihre tödliche Wirkung gegen die Krebszellen entfalten. Soweit zumindest die Theorie.

Damit dieser therapeutische Ansatz die gewünschten Erfolge liefern kann, müssen allerdings bestimmte Parameter der Anwendung optimal eingestellt sein. Ein solcher Faktor ist die DAR (Drug Antibody Ratio), welche ein Maß für die Kopplung des Wirkstoffs an den Antikörper darstellt. Die DAR hat entscheidenden Einfluss auf die Effektivität des Präparates, aber auch auf dessen Verträglichkeit und die mögliche Toxizität für den Patienten. Überdies wirkt sich dieser Parameter stark auf die Stabilität der Präparation und die Bildung von Aggregaten aus. Grund genug also, diese Kenngröße für jeden Entwicklungsschritt auf dem Weg zu einem neuen ADC genau im Auge zu behalten.

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Üblicherweise geschieht das mithilfe der Massenspektroskopie (z.B. MALDI-TOF oder ESI-MS) oder auch durch UV-Spektroskopie. Allerdings besitzen beide Techniken auch Nachteile: So sind beispielsweise die Berechnungen auf Grundlage von Daten aus der UV-Absorption schwierig, weil die Extinktionskoeffizienten von Antikörper und Toxin sehr nahe beieinander liegen. Die Massenspektrometrie wiederum liefert zwar gute Daten zum Molekulargewicht, die jedoch nur dann verlässlich sind, wenn die Ionisierung aller Komponenten gleich effektiv erfolgt. Dies ist leider bei ADCs nicht immer der Fall.

In diesem Anwendungsbericht stellen wir eine Methode vor, bei der die Drug Antibody Ratio mittels SEC-MALS (Mehrwinkel-Lichtstreuung oder Multi Angle Light Scattering) in Verbindung mit UV- und RI-Messung bestimmt werden kann. Die hierbei eingesetzte ASTRA 6 Software verwendet dazu die dn/dc-Werte (die das differentielle Inkrement des refraktorischen Index einer Substanz beschreiben) und die Extinktionskoeffizienten der Komponenten. Diese Werte lassen sich entweder messen oder aus entsprechenden Datenbanken entnehmen. Daraus werden dann die Molekülgewichte sowohl für den Gesamtkomplex als auch für seine Bestandteile berechnet.

Als Beispiel haben wir einen alkylierten Antikörper von ca. 155 kDa Molekülgewicht ausgewählt, der in zwei unterschiedlichen Präparationen (ADC 1 und ADC 2 genannt) mit einer Verbindung von etwa 1250 Da Molekulargewicht komplexiert wurde. Das gesamte Molekülgewicht des ADC wurde für den ersten Ansatz mit 167,8 kDa und für den zweiten mit 163,7 kDa ermittelt. Dies bedeutet, dass in den Proben eine unterschiedliche Anzahl von Wirkstoffmolekülen vom Antikörper gebunden wurde. Diese Annahme findet man bestätigt, wenn man das Molekülgewicht des Konjugates in den beiden Präparaten vergleicht: Einmal sind es 12,6 kDa, das andere Mal 8,1 kDa. Dadurch ergeben sich unterschiedliche DAR-Werte für die beiden Proben, weil diese ja das Mengenverhältnis zwischen Antikörper und gebundenem Wirkstoff beschreiben. Die ermittelten Zahlenwerte sind in der Tabelle unter Bild 2 wiedergegeben und wurden auch mit orthogonalen Methoden bestätigt.

An dem hier gezeigten Beispiel kann man erkennen, dass sich durch Kopplung von Säulenchromatographie an die Detektion mittels Statischer oder auch Mehrwinkel-Lichtstreuung durch ein Wyatt miniDAWN-TREOS- Instrument (Bild 3) sehr zuverlässige Messungen von Molekülgewichten durchführen lassen. Da die MALS-Technologie absolute Werte liefert, also nicht von Standards abhängig ist, bietet sie ideale Voraussetzungen für die Kontrolle von therapeutischen Makromolekülen wie etwa monoklonalen Antikörpern, die sowohl alleine als auch in Komplexen charakterisiert werden können. SEC-MALS stellt somit ein leistungsfähiges Werkzeug sowohl in der Entwicklung als auch für die Qualitätskontrolle solcher Verbindungen dar.

Autor:
Thomas Jocks
thomas.jocks@wyatt.EU

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