Ionisationstechniken in der LC/MSEin Überblick für Einsteiger

Die LC/MS hat sich in den letzten Jahren zu einer unverzichtbaren Analysentechnik entwickelt, die einen routinefähigen Reifegrad erlangt hat. Anfänger sollten von Beginn an den wichtigsten hier skizzierten Ionisationstechniken die größte Aufmerksamkeit widmen. Das gilt auch bzw. besonders für Umsteiger von der GC/MS. Dort hat sich die Elektronenstoß-Ionisation (Electron Impact; EI) mit der meist einheitlichen Ionisations- energie von 70 eV als universell verwendbare Technik etabliert und so die Basis für sehr umfangreiche Spektrenbibliotheken geschaffen. Während EI auch auf GC/MS-Systemen verschiedener Hersteller vergleichbare MS-Spektren liefert, stellt sich die Ionisation bei der LC/MS wesentlich komplexer dar. Andererseits muss nur noch in der GC/MS für Vakuum in der Ionenquelle gesorgt werden, denn in der LC/MS haben sich Ionisationstechniken durchgesetzt, die für Normaldruck optimiert sind. Sie gehören damit zu den API-Techniken (Atmospheric Pressure Ionisation), welche der Anwendbarkeit der LC/MS in der Routineanalytik zum Durchbruch verholfen haben. Ein API-Interface zwischen HPLC und Massenspektrometer verbindet zwei völlig unterschiedliche Welten. Der notwendig hohe Druck der HPLC wird an einem Ende des Interface auf Normaldruck reduziert, während am anderen Ende der Massenanalysator nur im Hochvakuum arbeiten kann. Dazu muss nicht nur eine Druckdifferenz von bis zu neun Zehnerpotenzen überbrückt, sondern auch der hohe Massenfluss des LC-Eluenten bewältigt werden.

Elektrospray-Ionisation (ESI)

Die Elektrospray-Ionisation ist eine der wichtigsten Interface-Techniken in der modernen LC/MS. Im Unterschied zu anderen API-Techniken, wie APCI und APPI (siehe unten), findet bei der ESI die Ionisierung der Analyten schon in gelöster Form statt, so dass sie als bereits geladene Teilchen in die Gasphase überführt werden. Sie wird daher hauptsächlich für polare und ionische Verbindungen eingesetzt und ist auch deswegen so verbreitet, da sie sich gut für hohe Molekulargewichte eignet (Bild 1). Insbesondere thermisch labile Analyten sind praktisch nur mit der ESI ionisierbar.

Die klassische Elektrospray-Ionisation mit sehr geringen LC-Flüssen wurde in den 80-iger Jahren von

John Fenn

(Chemie-Nobelpreis 2002) entwickelt. Der flüssige Eluent wird dabei durch eine geheizte Metallkapillare (ca. 0,1 mm Innendurchmesser) geleitet, die ca. 2…6 kV Potentialdifferenz zur gegenüberliegenden Elektrode aufweist und so ein sehr hohes elektrisches Feld von ca. 10

⁶

V/m erzeugt. Durch

Tom Covey

wurde die Technik durch die Verwendung eines Vernebelungs-Gases (Sheath-Gas; Nebulizer; meist N

₂₎

weiterentwickelt, welches den Verdampfungsprozess unterstützt. Dadurch wird die ESI auch für die in der klassischen LC üblichen hohen Flussraten von 1 ml/min einsetzbar.

Dazu wird die geladene Stahlkapillare von einem weiteren Rohr umhüllt, aus dem das „Nebulizer Gas“ strömt und die finale Verdampfung beschleunigt (Bild 2). Die pneumatisch unterstützte Zerstäubung zeigt ihre Vorteile auch bei den durch Gradienten- elution variierenden Zusammensetzungen der mobilen Phase. Als weitere Unterstützung werden auch spezielle Zusatzbeheizungen eingesetzt (Infrarot; heiße Stickstoff-Ströme aus verschiedenen Richtungen, etc.).

Im positiven Elektrospraymodus „ESI(+)“ ist das Potential der Spitze der Kapillare z.B. positiv aufgeladen, und es kommt durch eine elektrophoretische Ladungstrennung zur Anreicherung von positiven Ionen an der austretenden Flüssigkeitsoberfläche und somit zur Bildung einer Überschussladung. Negative Ionen wandern hingegen zum positiv geladenen Kapillarende und werden an dessen Rand entladen (es können schätzungsweise bis 50 % der negativen Ionen entfernt werden).

Im weiteren Verlauf bildet sich durch die Abstoßung der positiv geladenen Ionen und dem Zug durch das hohe elektrische Feld ein Flüssigkeitskegel („Taylor Cone“) aus (Bild 3, rechts oben). Schließlich wird dieser Flüssigkeitskegel instabil, und es bildet sich ein Flüssigkeitsstrahl mit einem Durchmesser von wenigen µm, dessen Oberfläche mit positiv geladenen Ionen angereichert ist, bis auch dieser instabil wird und in kleine hochaufgeladene Tröpfchen zerfällt. Am effektivsten werden diese winzigen Tröpfchen bei kleinen Flussraten sowie unter Verwendung von organischen Lösungsmitteln mit niedriger Dichte und Oberflächenspannung erzeugt.

Coulomb-Explosion [1]

Die Tröpfchen des primär gebildeten Nebels weisen einen Radius von ca. 1…3 µm auf. Dabei verteilen sich ca. 50 000 Elementarladungen gleichmäßig über die jeweilige Tröpfchenoberfläche. Durch die stattfindende Lösungsmittelverdampfung, welche durch die Zufuhr von Wärme weiter beschleunigt wird, verringert sich der Radius dieser Tröpfchen immer mehr, bis die elektrostatischen Coulomb-Abstoßungskräfte zwischen den gleichgeladenen Ionen größer sind als die kohäsiven Kräfte des Lösungsmittels (die notwendige Ladung für einen solchen Prozess ist von der Oberflächenspannung des Lösungsmittels und dem Tröpfchenradius abhängig und kann nach der Rayleigh-Gleichung berechnet werden). Ist das sog. Rayleigh-Limit erreicht, kommt es in einer Coulomb-Explosion schließlich zur Spaltung der Ausgangströpfchen (Parent droplets) in kleinere Tröpfchen (Offspring droplets), deren Radius ungefähr um eine Zehnerpotenz reduziert wird. Es folgen weitere Kaskaden von Aufspaltungen (Bild 3).

Für die Beschreibung der Bildung von Gasphasenionen existieren zwei verschiedene Modelle, das „Charged residue model“ und das „Ion evaporation/emission/desorption model“.

Das erste Modell basiert auf der Bildung von extrem kleinen Tröpfchen mit einem Radius von ca. 1 nm, die nur noch ein einziges Ion enthalten. Die vollständige Verdampfung eines solchen Tropfens führt letztlich zur Bildung eines nackten Gasphasenions (vermutlich gültig für große Moleküle wie z.B. Proteine).

Das zweite Modell, das eher auf kleine Moleküle zutrifft, geht davon aus, dass bei einem Tröpfchenradius von ca. 8…20 nm und ca. 70 Elementarladungen die Ionen direkt aus der Tröpfchenoberfläche in die Gasphase emittiert werden (

Irbarne

und

Thompson

).

Für einen stabilen Elektrospray müssen schon im Eluenten genügend Ionen vorhanden sein, daher werden oft flüchtige Elektrolyte wie Essig- oder Ameisensäure bzw. deren Ammoniumsalze in geringen Konzentrationen (bis max. 10 mMol) als Zusätze für die mobile Phase verwendet. Auch die Eigenschaften der LC-Laufmittel wie Viskosität, Leitfähigkeit, Oberflächenspannung und Polarität haben einen Einfluss auf den Ionisierungsprozess. Da die Ionisation durch kleine Anfangströpfchen begünstigt wird, sind mobile Phasen wie reines Wasser mit hoher Oberflächenspannung und/oder Viskosität ungünstig. Besondere Bedeutung hat auch der pH-Wert. So wird die Produktion positiver Ionen durch saure Bedingungen meist begünstigt.

ESI ist eine der sanftesten Ionisierungstechniken und produziert daher (ganz im Gegensatz zur Electron Impact in der GC/MS) hauptsächlich Molekülionen, deren Zusammensetzung jedoch stark von den Rahmenbedingungen abhängt. Bei Molekülen mit einer molaren Masse <1000 Dalton (Da) werden in der Regel einfach positiv bzw. negativ geladene Quasimolekülionen beobachtet. Diese entstehen durch Protonierung [M+H]

⁺

oder Kationen-Anlagerung [M+Kat]

⁺

(Kat = Na, K, etc.) bei positiver Ionendetektion. Im Fall von negativer Polarität werden oft intensive Ionen des Typs [M-H]

^–

gebildet. Fragmentierungen werden wegen der sanften Ionisation bei ESI nur mit geringen Intensitäten beobachtet.

Bei sehr großen Molekülen, die mehrere Strukturstellen besitzen, welche protoniert (positive Ladung) bzw. deprotoniert (negative Ladung) werden können, kommt es auch zu komplexen Mischformen mit teils Mehrfachladungen wie [M+2H]

²⁺

, [M+3H]

³⁺

, [M+4H]

⁴⁺

, etc. Die Signale im Massenspektrum liegen aufgrund der Trennung nach dem Masse-zu-Ladung-Verhältnis (m/z bzw. m/q = 1 Th Thomson) dann bei Massenzahlen entsprechend der Hälfte von [M+2], einem Drittel von [M+3], einem Viertel von [M+4], usw. So können auch große Moleküle mit dem eingeschränkten Massenbereich von Quadrupolen gemessen werden. Die Elektrospray-Ionisation ist nicht zuletzt deshalb am weitesten verbreitet und mit einem großen Bereich von HPLC-Bedingungen kompatibel.

Der ESI-Prozess ist jedoch anfällig gegen Suppressions-Effekte, da die Analyten, aber auch alle anderen ionisierbaren Verbindungen, wie Puffer, Additive und insbesondere simultan eluierende Matrixkomponenten, um die begrenzten Ladungen auf der Tröpfchenoberfläche konkurrieren. Diese Matrix-induzierte Konkurrenz beim Ionisationsprozess macht die Quantifizierung in Form der gefürchteten Matrix-Effekte problematisch.

Vorteile der ESI



 Ionisierung findet direkt aus der Lösung heraus statt (geeignet sowohl für ionische als auch für thermisch labile Substanzen).



 Weiter Flussraten-Bereich (nl/min bis über 1 ml/min).



 Infolge Mehrfachladung auch für sehr hohe Massenbereiche geeignet.

Nachteile der ESI



 Nicht geeignet für unpolare Verbindungen.



 Spektren hängen von vielen Randbedingungen ab.



 Meist Suppressions-Effekte (Matrix-Effekt).



 Sanfte Ionisation führt zu intakten Molekülionen und damit zu geringer Strukturinformation (ist wiederum ein Vorteil für MS/MS-Techniken).

Atmospheric Pressure Chemical Ionisation (APCI)

Die Ionisationstechniken Atmospheric Pressure Chemical Ionisation (APCI) und Atmospheric Pressure Photo Ionisation (APPI) finden wie die Elektrosprayionisation bei Normaldruck statt und gehören damit auch zu den modernen LC/MS-Interfacetechniken. Im Gegensatz zur ESI findet die Ionisierung jedoch nicht schon in der flüssigen Phase statt, sondern durch chemische Ionisation in der Gasphase. Die solvatisierten Verbindungen werden dabei mittels eines Stickstoffstromes in eine beheizte Kammer („Heated Pneumatic Nebulizer“; Vaporizer; bis ca. 400 °C) gesprüht, in der es zur Verdampfung des Lösungsmittels und auch der Analyten kommt. Durch diese Desolvatisierung werden die Analyten als neutrale Teilchen freigesetzt. Sie sollten daher möglichst nicht-ionisch in Lösung vorliegen und relativ thermostabil sein.

Im Anschluss an den Verdampfungsprozess strömt die gebildete Dampfphase bei der APCI in den Bereich einer hochaufgeladenen Gasentladungsnadel („Corona Discharge Needle“), an der durch Anlegen einer sehr hohen Spannung zwischen 2 und 5 kV ein Plasma von positiv geladenen Reaktandionen erzeugt wird (Bild 4). Das elektrische Feld um die Nadelspitze muss groß genug sein zur Ionisation des umgebenden Gases, ohne jedoch Blitze zu erzeugen. Abhängig vom gewählten Laufmittelgemisch entstehen z.B. folgende Reaktandionen: CH

₃

OH

₂

⁺

(H

₂

O)

_n

(CH

₃

OH)

_m

bei Methanol, CH

₃

CNH

⁺

(H

₂

O)

_n

(CH

₃

CN)

_m

bei Acetonitril und H

₃

O

⁺

(H

₂

O)

_n

bei Wasser.

Die Reaktandionen gehen wiederum mit den Analyten Gasphasen-Molekülreaktionen ein, indem abhängig von der Gasphasenbasizität der zu ionisierenden Verbindungen Protonen auf sie übertragen werden. Schließlich kommt es zur Bildung von protonierten Gasphasenionen der Zielanalyten.

Im Vergleich zu Niederdruck-Quellen (EI/CI) ergibt sich bei API-Systemen das Problem, dass Ionen unter Atmosphärendruck erzeugt, dann aber möglichst verlustarm in den Hochvakuumteil des Massenanalysators transferiert werden müssen. Die im Normaldruckbereich gebildeten Ionen werden daher zuerst durch eine sehr kleine Öffnung (Orifice) mit spezieller Ionen-Optik geleitet und dann über mehrere Druckstufen bis in den Hochvakuumteil geführt.

Der Abkühlung durch adiabatische Expansion, welche zur unerwünschten Clus-terbildung führt, kann dabei durch eine beheizte Transferkapillare („Ion Transfer Tube“; Bild 5) oder einem warmen Gasstrom entgegengewirkt werden (Curtain Gas; Bild 6 rechts).

Die APCI-Technik ist für Verbindungen mit einem Molekulargewicht von bis zu 1500 Dalton geeignet, da sie im Gegensatz zur ESI nicht in der Lage ist, mehrfach geladene Molekülionen zu erzeugen.

APCI funktioniert mit Eluentenströmen von 0,5…2,0 ml/min und ist selbst mit 4,6-mm-LC-Säulen gut kompatibel. Die Toleranz gegenüber Puffern, sowohl hinsichtlich Auswahl als auch Konzentration, kann als sehr gut bezeichnet werden.

Als LC-Laufmittel ist das protische Methanol besser geeignet als aprotische Lösungsmittel wie z.B. Acetonitril, da bei aprotischen Eluenten alle Wasserstoff-Atome kovalent am Kohlenstoff gebunden sind und deshalb nicht oder nur sehr schwer als Protonen abgespaltet werden können.

Die Kinetik der Ionen/Molekül-Reaktionen ist bei API-Techniken (verglichen mit der chemischen Ionisation CI im Vakuum der GC/MS-Ionenquelle) durch den vergleichsweise hohen Druck und der damit verbundenen hohen Stoßzahl sehr günstig für gute Sensitivität.

Durch die für chemische Ionisationen typischen, sehr milden Bedingungen entstehen vorwiegend nur einfach geladene Ionen vom Typus [M+H]

⁺

bzw. [M-H]

^–

und kaum Fragmente. Die Gegenwart von chromatographischen Modifiern, die unbedingt flüchtig sein sollen, wie z.B. Ammoniumacetat, führt im positiven Modus zu [M+NH

₄

]

⁺

bzw. [M+CH

₃

COO]

^–

im negativen Modus. Zusätzlich treten unter dem Einfluss der Lösungsmittel-Moleküle auch Ionen-Cluster auf, die durch Techniken wie „Cone-Voltage“-Fragmentierungen wieder aufgelöst werden müssen.

Durch weitere Erhöhung der Cone-Voltage lässt sich eine sogenannte „In-Source-Fragmentierung“ provozieren. Dabei erhält man auf Kosten einer deutlich verschlechterten Empfindlichkeit durch „Collision Induced Dissociation“, CID, über die gebildeten Fragmente mehr Molekülinformationen (z.B. bei Single-Quadrupol-Systemen).

APCI und ESI unterscheiden sich vom Hardwareaufbau im Wesentlichen nur durch die Corona-Nadel; ein Umbau bzw. Wechsel zwischen beiden Techniken ist daher meist einfach durchzuführen (manche Hersteller bieten auch sog. Multi-Mode-Quellen an).

Die anfangs gehegte Hoffnung, APCI leide viel seltener bzw. deutlich weniger unter den Matrixeffekten als ESI, hat sich nicht immer bestätigt (es zeigen sich teils starke Analyt-spezifische Unterschiede hinsichtlich Ion-Suppression oder auch Ion-Enhancement).

Vorteile APCI



 Sehr gute Eignung für un- bis niedrigpolare Analyten.



 Verträgt sich auch mit Flussraten bis über 2 ml/min (z.B. aus 4,6 mm-LC-Säulen).



 Höhere Toleranz gegen Puffer in der mobilen Phase (größere Auswahl; bis 100 mMol möglich).



 Toleranter gegen Änderungen der Eluentenzusammensetzung als ESI.

Nachteile APCI



 Höhere Neigung zur Addukt-Bildung.



 Wenig effizient bei sehr kleinen Flussraten.



 Sanfte Ionisierung mit geringer Fragmentierungsinformation (ist allerdings ein Vorteil für MS/MS).



 Nicht geeignet für in Lösung bereits geladene Analyte.

Atmospheric Pressure Photo Ionisation (APPI)

Diese neuere Technik wurde erstmals 2000 beschrieben und ist eine Abwandlung der APCI mit dem Unterschied, dass nicht eine Corona-Nadel die Energie für die Ionisierung bereit stellt, sondern eine Photoionisationslampe (Krypton 10,6 eV) (Bild 6).

Unpolare Verbindungen, welche die Strahlung absorbieren können und eine Ionisierungsenergie unter 10 eV besitzen, werden von den emittierten Photonen ionisiert. APPI ist dann selektiv, wenn die Ionisierungsenergien aller anderen Matrixbestandteile über 10,6 eV liegen.

Bei der direkten Atmospheric Pres- sure Photo Ionisation bildet sich das Radikalkation des Zielanalyten unmittelbar. Ist dessen Protonenaffinität größer als die des umgebenden protischen Lösungsmittels, können [M+H]

⁺

-Kationen gebildet werden (Bild 7).

Um die Anwendungsmöglichkeiten der APPI zu erweitern, hat man die Dopant Assisted-APPI (DA-APPI) entwickelt. Bei dieser indirekten Technik werden dem Eluenten 1…5 % einer leicht ionisierbaren Verbindung zudotiert. Daraus werden im ersten Schritt sog. Dopant-Photoionen in großem Überschuss gebildet. Sie können durch Ladungstransfer oder durch Protonenübertragung eine Ladung auf die Zielanalyten induzieren. Typische Dotiersubstanzen (Dopant) sind Aceton, Toluol und Anisol.

Diese Technik ist noch weniger weit verbreitet und meist speziellen Anwendungen vorbehalten (PAK; Weichmacher, etc.).

Literatur

1. Robert K. Boyd, Cecilia Basic, Robert A. Bethem, „Trace Quantitative Analysis by Mass Spectrometry“; WILEY ISBN: 978-0-470-05771-1; April 2008.