Downsizing der LC-Phasenpartikel

Das Großartige am Kleinen

Die moderne Ultra High Performance Liquid Chromatography UHPLC ermöglicht Drücke bis weit über 1000 bar und treibt damit die Entwicklung der Säulentechnologie in Richtung feinere Trennmaterialien voran. Partikelgrößen unter 2 µm und nur an der Oberfläche poröse Spezialmaterialien versprechen noch mehr Trennleistung in kürzerer Analysenzeit.

Schon seit geraumer Zeit gilt die klassische Säulen-Dimension 250 × 4,6 mm mit 5-µm-Partikeln mit rund 20 000 Böden als die Standard-Säule und als das „Arbeitspferd“ der Flüssigkeitschromatographie. Für solche Standardanwendungen, die nicht ohne weiteres auf die UHPLC mit Sub-2-Micron-Material transferiert werden können oder dürfen (z.B. aufgrund von festgelegten Vorgaben und unflexiblen Regulatorien etc.), ist ein erster Downsizing-Schritt auf 150 × 4,6 mm mit 3-µm-Partikeln jedenfalls einen Versuch wert. Bei vergleichbarer Auflösung gewinnt man dabei rund 40 % an Analysenzeit [1]. Der theoretische Hintergrund ist, dass sich die Trennstufenzahl N proportional zum Verhältnis zwischen der Säulenlänge L und der Partikelgröße dp verhält: N ~ L / dp

Größe durch Downsizing
Mit der Reduzierung auf 3-µm-Teilchen kann somit auch die Säule auf 150 mm verkürzt werden (250 / 5 entspricht 150 / 3). Das effizientere 3-µm-Material hat sich in der Regel als ebenso zuverlässig erwiesen und ist noch mit konventionellen HPLC-Anlagen kompatibel. Vorsicht ist trotzdem bei Proben mit sehr hohem Matrixanteil (z.B. „Dilute & Shoot“-Methoden) geboten, denn 3-µm-Säulen besitzen oft mit 0,5 µm wesentlich feinere Fritten als die konservativen 5-µm-Säulen, die üblicherweise mit 2-µm-Fritten auskommen.

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Für weitere Überlegungen bezüglich der Trennleistungssteigerung soll kurz die Van-Deemter-Gleichung bemüht werden. Wie für alle chromatographischen Methoden ist sie mit der daraus resultierenden Kurve auch in der HPLC ein zentrales Element zur Erklärung und Ableitung des Einflusses von chromatogra-phischen Parametern (Bild 1).

Bild 1: Einflussgrößen für die (U)HPLC nach Van Deemter. (Bild: Agilent Technologies).

Die Van-Deemter-Gleichung besteht aus den Termen A (blau), B (grün) und C (rot), deren grafische Darstellungen die Zusammenhänge zwischen der linearen Fließgeschwindigkeit „u“ (Linear Velocity) und der Bodenhöhe „H“ (Plate Height) zeigen. In Summe resultiert daraus die Van-Deemter-Kurve (schwarz), wobei zu bemerken ist, dass die Bodenhöhe umgekehrt proportional zur resultierenden Trennstufenzahl „N“ steht. Für die Plate Height H gilt daher: weniger (Bodenhöhe) ist mehr (Trennleistung).

Verbesserung durch Gleichmäßigkeit
Der A-Term resultiert aus der Eddy-Diffusion. Diese Streu- oder Wirbeldiffusion entsteht durch unterschiedlich lange Flusswege, die einzelne Analytmoleküle zwischen den Partikeln zurücklegen können (grafische Darstellung rechts unten in Bild 1). Unterschiedliche Partikelgrößen und schlechte, d.h. unregelmäßige Packungen des Säulenbettes vergrößern den Term A, der praktisch nicht von der Fließgeschwindigkeit u beeinflusst wird.

Ein Vergleich der Größenverteilung von Partikel-Typen in Bild 2 zeigt, dass schon in diesem Zusammenhang die neue Herstellungstechnologie von sog. „Superficially Porous Particles“ (SPP) im Vorteil ist (weitere Vorzüge dieses neuen Materials werden beim C-Term erläutert). Die Streubreite von SPP-Materialien konnte wesentlich verringert werden, was den A-Term durch eine homogenere Packung mit gleichmäßigeren Teilchen reduziert und damit die Trennleistung erhöht.

Bild 2: Als Abweichung von der jeweiligen mittleren Partikelgröße dargestellte Partikelgrößen-Verteilung bei verschiedenen voll porösen Materialien (blaue, grüne, schwarze Kurven) im Vergleich zu Superficially Porous Particle-Material (2,7 μm in Rot) (Bild: Agilent Technologies).

In Term B steckt die so genannte Longitudinal-Diffusion, die von der Viskosität und Temperatur des Eluenten abhängt. Ausgehend von einem konzentrierten Probenzonen-Zentrum diffundieren die einzelnen Analyten im Laufe der Chromatographie kontinuierlich in beiden Richtungen der Säulenlängsachse auseinander. Je kürzer die Verweilzeit in der Trennsäule ist, desto geringer ist der Beitrag der Longitudinal-Diffusion und deshalb sinkt der B-Term schnell mit steigender Fließgeschwindigkeit (grüne Kurve in Bild 1).

Effizienz durch Massen- transfer-Beschleunigung
Der besonders wichtige C-Term (Bild 1, rote Gerade) beschreibt den Widerstand beim Massentransfer zwischen der stationären und der mobilen Phase. Da der Stoffaustausch grundsätzlich etwas Zeit benötigt, wird er durch geringe Flussraten begünstigt, daher verhält sich der C-Term auch proportional zur Fließgeschwindigkeit. Während schnelle Chromatographie (u wird größer) die unerwünschte Longitudinal-Diffusion stark zurückdrängt, ist ihr Einfluss auf einen intensiven Stoffaustausch wiederum kontraproduktiv. Der Massentransfer ist unter anderem auch von der Art der mobilen Phase, Länge und Durchmesser der

Säule und Porosität der Teilchen abhängig. Bleiben diese Parameter gleich, wird wie in Bild 1 (rechts) deutlich, dass die Massenübertragung vom Teilchendurchmesser bestimmt wird.

Genau diese Möglichkeit, den Massentrans-fer mit kleinen Teilchen zu verbessern und damit den C-Term zu reduzieren, ist der Grund für den zunehmenden Marktanteil an Sub-2-Micron-Säulen.

Bild 3: Größenvergleich (schematische Darstellung) von Sub-2-Micron- (links) und Superficially Porous Partikeln („Poroshell“; rechts). (Bild: Agilent Technologies)

Die neuen Säulen mit 1,7- bis 1,8-µm-Partikeln sind deutlich effizienter als klassische Partikelgrößen (5 bzw. 3 µm), stellen aber auch wesentlich höhere Ansprüche an die LC-Hardware. Es bauen sich wesentlich höhere Rückdrücke auf, und deutlich engere und kürzere Verbindungskapillaren sind notwendig, um deren Todvolumen klein zu halten. Im selben Maße steigen die Anforderungen an die Partikelfreiheit der Lösungen und Proben. Der Trend in die Richtung unter 2 µm wird aber trotz aller Erschwernisse anhalten.

Den Verbesserungseffekt im C-Term durch gesteigerten Massentransfer kann man auch nutzen, wenn die absolute Partikelgröße zwar 2,7 µm beträgt, aber die trennrelevante Zone z.B. nur 0,5 µm dick ist. Damit sind wir bei den neuen oberflächenbeschichteten Partikeln (Su-perficially Porous Particles; SPP). Sie werden sich mit ihrer verbesserten und gleichmäßigeren Partikel-Morphologie steigender Beliebtheit erfreuen. Sie besitzen als Träger einen undurchlässigen, stabilen Kern und nur die Randschicht ist als poröse Struktur für die Analyten zugänglich (Bild 3 und Bild 4). Dadurch reduziert sich die Wege-Variabilität und die Effizienz steigt um ca. 25 % gegenüber völlig porösem Standardmaterial (Totally Porous Particle TPP).

Aber auch bei den neuen SPP-Materialien wird das hohe Drucklimit moderner UHPLC-Hardware ausgenutzt, denn einige Säulenhersteller haben bereits die Partikelgröße ihrer neuesten SPP-Generation auf 1,6 µm reduziert (siehe Bild 5).

Bild 4: Vergleich der unterschiedlichen Weglängen, wie ein Analyt in verschiedene Typen von Trennmaterialen eindringen kann (links: TPP; rechts: SPP). Je geringer die Unterschiede der Diffusionsstrecken sind, desto schlanker werden die Peaks . (Bild: Thermo Scientific)

Oft wird befürchtet, dass die neuen Superficially Porous Partikel weniger Probenkapazität als gleich große konventionelle Totally Porous Partikel aufweisen. Theoretisch ergibt sich bei den SPP mit 2,7 µm Teilchendurchmesser und 0,5 µm Shell-Dicke tatsächlich ein um ca. ein Viertel geringerer Anteil an porösem Trennmaterial, das aktiv an der Trennung beteiligt ist. Großteils hat sich bei Vergleichsmessungen mit verschiedenen Produkten diverser Hersteller aber gezeigt, dass die Probenkapazitäten von SPP unter gleichen Bedingungen jenen von TPP in der Praxis durchaus ähnlich sind [1]. Für detaillierte Vergleiche zwischen HPLC und UHPLC bzw. TPP, SPP und Sub-2-Micron muss aus Platzgründen auf neue Ansätze wie dem so genannten Poppe-Plot bzw. Kinetic-Plot [2] verwiesen werden. Bei der 1997 von H. Poppe entwickelten alternativen Darstellung werden die Unterschiede von Säulentypen hinsichtlich des C-Term-dominierten Bereichs (d.h. die Massentransfer-Limitierungen) sichtbar.

Trennungen verändern sich unter Druck
Durch die Verfügbarkeit von vielen Sub-2-Micron-Säulen und der immer weiter verbreiteten Ausrüstung mit UHPLC-Hardware ist der Einfluss von sehr hohen Drücken bzw. Druckunterschieden in den Fokus des Interesses gerückt. Zahlreiche Untersuchungen haben sich mit den Auswirkungen auf verschiedene Parameter beschäftigt. Bei einer Präsentation auf der „HPLC2013 Amsterdam“-Konferenz hat Ronald E. Majors die komplexen Ergebnisse zusammengefasst [4]. Stark vereinfacht ergeben sich daraus folgende Erkenntnisse für eine Steigerung des Pumpendrucks um jeweils 500 bar:

  • Neutrale Analyte mit niedrigem Molekülgewicht können ihr Retentionsverhalten um bis zu 12 % ändern. Bei den meisten waren aber nur Änderungen des K-Werts um 2 – 6 % in Systemen mit Wasser-Acetonitril bzw. Wasser-Methanol zu beobachten.
  • Hochmolekulare Substanzen aus dem Neutralbereich steigern ihre Retention jedoch um bis zu 50 % bei derselben Drucksteigerung (500 bar).
  • Ähnliches Verhalten zeigen ionisierte Analyten (saure u. basische) in Puffersystemen.
Bild 5: Rasterelektronenmikroskop-Bilder vom Querschnitt der aktuellen SPP-Generation (links: dzt. kleinster Durchmesser). (Bild: Waters)

Diese Ergebnisse sind interessant und teilweise erstaunlich, haben aber nur geringe praktische Auswirkungen auf die tägliche Arbeit des Analytikers. Druckunterschiede von 500 bar kommen in der Routinepraxis sehr selten vor. Bei der Methodenentwicklung sollte man sich eines gewissen Änderungspotenzials durch den Hochdruck zumindest bewusst sein. Bei der Übertragung von Methoden mit 5-µm-Säulen auf 1,7- bis 1,8-µm-Partikeln, und noch dazu bei hohen Flussraten, sollte man auch an die Möglichkeit von Retention-Shifts und eventuell sogar an Selektivitätsänderungen durch die starke Rückdrucksteigerung denken.

Abschließend kann aus Sicht des Autors folgende Prognose für die LC-Trennmaterialien gewagt werden:

  • Robuste Säulen mit 5-µm-Partikel (Totally Porous Particles) werden ihre Bedeutung besonders für Applikationen mit sehr hohem Matrixanteil noch länger behalten.
  • Wenn es um schnelle Trennungen bei hohen Flussraten und üblichen Trennzahlen geht, sind Sub-2-Micron-Partikel und SPP in kurzen Säulen den großen, voll porösen Materialien überlegen.
  • Der breite Anwendungsbereich dazwischen wird zunehmend von der neuen Technologie mit Superficially Porous Particles erobert werden.
  • Wird unbedingt eine außergewöhnlich hohe Anzahl von Trennstufen benötigt, sind die herkömmlichen 5-µm-Teilchen in sehr langen Säulen die bessere Wahl. Die gesteigerte Peakkapazität muss jedoch mit einem hohen Zeitaufwand bei der Chromatographie teuer bezahlt werden.

Literatur
[1] Michael W. Dong; “Seven Common Faux Pas in Modern HPLC”; LC*GC Europe; S415-419; August 2014
[2] Ronald E. Majors; „The Top 10 HPLC and UHPLC Column Myths: Part 1“;LC*GC Europe; S584-592; 2013
[3] G. Desmet, D. Clicq, and P. Gzil, Anal. Chem. 77, 4058; 2005
[4] Ronald E. Majors; „The Top 10 HPLC and UHPLC Column Myths: Part 2“; LC*GC Europe; S630-636 November 2013

Wolfgang Brodacz
AGES, 4020 Linz
E-Mail: wolfgang.brodacz@ages.at

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