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Lebensmittelanalytik - Gesunde Fette in Chips und Würstchen?

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Fraktionen nahtlos verpacken und mehr: Meine HPLC tropft

Koppelt man die hochdruckstabile Chip-HPLC an die Tröpfchenmikrofluidik, entsteht eine neue Technologie. Sie vereint die mikrofluidische Welt der Trenntechniken mit der Welt der Tropfenmikrofluidik.

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LebensmittelanalytikGesunde Fette in Chips und Würstchen?

Eine neue Methode für Extraktion, Aufschluss und Analyse von Fett in Lebensmittelproben. Die EU-Verordnung Nr. 1169/2011 des europäischen Parlaments verlangt ab 2016 eine detaillierte Nährwertangabe von Lebensmitteln, insbesondere die Unterscheidung von Fett in gesättigte und ungesättigte Fettsäuren [1]. Diese Unterscheidung ist für den Konsumentenschutz bedeutsam. Beispielsweise empfehlen die amerikanische „Dietetic Association“ (ADA), die„European Food Safety Authority“ (EFSA) und die amerikanische „Academy of Nutrition and Dietetics“, weniger als 35 % des täglichen Energiebedarfs durch Fett abzudecken; gemäß ADA sollten weniger als 20 % einfachungesättigte Fettsäuren sein (MUFA).

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Lebensmittelanalytik: Gesunde Fette in Chips und Würstchen?

Die Bestimmung des Gesamtfettgehalts sowie der ungesättigten und gesättigten Fettsäuren in Nahrungsmitteln wird nach Methoden durchgeführt, die auf ISO-Standards basieren. Je nach Lebensmittelart werden Techniken wie die Röse-Gottlieb- oder die Weibull-Stoldt-Extraktion eingesetzt, um den Gesamtfettgehalt zu bestimmen [2, 3].

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Die nachfolgend beschriebene Analyse gesättigter und ungesättigter Fettsäuren wird mit Hilfe der Gas-Chromatographie (GCFID) vorgenommen. Diese Analyse erfordert eine Umsetzung von Fettsäuren in Fettsäuremethylester (FAMEs) entsprechend der ISO-Norm [4]. Ungesättigte Fettsäuren sind empfindlich gegenüber Oxidationsvorgängen, die durch Luftkontakt ausgelöst und durch Hitze beeinflusst werden. Daher wurde ein schonender zweistufiger Mikrowellenablauf entwickelt, der für unterschiedliche Nahrungskomponenten in einem geschlossenen System durchgeführt wird. Dieses neue Mikrowellenverfahren ist schneller, preisgünstiger und umweltfreundlicher als das herkömmliche ISO-Verfahren. Es wird angenommen, dass die oxidations-empfindlichen ungesättigten Fettsäuren im Mikrowellenverfahren schonender behandelt und damit die Oxidation minimiert wird, was zu einem besseren Analyseergebnis von ungesättigten Fettsäuren führt.

Methoden
Konventionelles ISO-Verfahren: Das konventionelle Standardverfahren basiert auf der ISO-Extrationstechnik (ISO 8262) zur Gesamtfettbestimmung in Milch und Milchprodukten gemäß Weibull-Berntrop und der Umsetzung von Fettsäuren in Fettsäuremethylester (FAMEs) entsprechend der ISO Methode (DIN EN ISO 12966-2). Die ISO 8262-Methode dient als die Basis und korreliert mit dem Weibull-Stoldt-Extraktionsverfahren zur Bestimmung des Gesamtfettgehalts in Lebensmittelproben.

Lebensmittelanalytik: Gesunde Fette in Chips und Würstchen?

Das ISO-Extraktionsverfahren nach Weibull-Stoldt basiert auf einem Verseifungsaufschluss mit Hilfe von Salzsäure und Wasser, was an Proteine gebundenes Fett in Nahrungsmittelproben freisetzt. In einer nachfolgenden heißen Filtration wird das freigesetzte Fett im Filter zurückgehalten. Er wird bis zur Neutralität gewaschen und anschließend getrocknet. Zum Schluss wird das Fett mit einem geeigneten Lösungsmittel in einem Soxhlet-Extraktor extrahiert, was mehrere Stunden dauert. Danach wird das Lösungsmittel mit einem Rotationsverdampfer entfernt und der Rückstand getrocknet. Die Gesamtfettbestimmung erfolgt durch Wiegen des getrockneten Fetts. Auf Grundlage des ISO-Verfahrens zur Probenaufbereitung für eine GC-Analyse erfordert die Umsetzung von Fettsäuren zu Fettsäuremethylestern (FAMEs) eine Folge alkalischer und saurer Derivatisierungsschritte in wasserfreier methanolischer Umgebung. Eine alkalische Umsetzung erzeugt FAMEs von Fettsäuren, die als Triglyzeride gebunden sind, und die Verseifung von freien Fettsäuren. Eine nachfolgende saure Umsetzung überführt schließlich die übrigen verseiften Fettsäuren in FAMEs. Die Reationsgleichungen sind in Abbildung 1 und 2 dargestellt.

Mikrowellenverfahren
Das neue Mikrowellenverfahren zur Fettbestimmung ist für das Mikrowellensystem. Discover SP-X® (CEM, Kamp Lintfort) entwickelt worden. Es besteht aus einer Mikrowellenextraktions-(MEM) und einer Mikrowellen-Derivatisierungsmethode (MDM). Die MEM wurde auf Basis der Weibull-Stoldt-Technik entwickelt und extrahiert das Gesamtfett in einer Nahrungsmittelprobe innerhalb eines geschlossenen Systems unter definierten Bedingungen bei gleichzeitiger Mikrowellenbestrahlung.

In einem geschlossenen System (einschließlich MDM) wird die Umsetzung der extrahierten Fettsäuren unter Mikrowellenbestrahlung durchgeführt. Die Umsetzung von Fettsäuren zu Fettsäuremethylestern (FAMEs) für eine nachfolgende GC-Analyse erfordert ebenfalls eine Folge von alkalischen und sauren Derivatisierungsschritten in wasserfreier methanolischer Umgebung.

Lebensmittelanalytik: Gesunde Fette in Chips und Würstchen?

GC-Analyse
Die Analyse der FAMEs der Lebensmittelproben wurde mit einem GC-2010 Plus AF Gas-Chromatograph mit FID-Detetor (Shimadzu) durchgeführt. Der Einfluss des Verfahrens zur Probenaufbereitung und zur Derivatisierung auf den Anteil ungesättigter Fettsäuren am Gesamtfettgehalt der Nahrungsmittelproben muss untersucht werden. Um den Gehalt ungesättigter und gesättigter Fettsäuren bei beiden Methoden zu vergleichen, wird die Gesamtsumme aller Fettsäure-Peakflächen berechnet (= 100 %). Peakflächen von ungesättigten und gesättigten Fettsäuren werden dann zusammengefasst, und das Verhältnis ungesättigter zu gesättigten Fettsäuren wird ermittelt. Dieser Ablauf wurde auf beide Verfahren, ISO- und Mikrowellenverfahren, angewendet.

Experimenteller Teil
ISO-Verfahren – Extraktionsmethode:
Die Nahrungsmittelprobe wird in einem 600 ml Becherglas eingewogen, in der Erwartung, dass ein Fettgesamtgewicht von 2 bis 3 g vorhanden sein wird. Der Probe werden 100 ml Wasser und 150 ml Salzsäure (25 Gewichts-%) zugegeben. Das Becherglas wird mit einem Glasdeckel abgedeckt, und die Probe wird dann für 30 bis 60 Minuten gekocht. Nach dem Aufschlussprozess wird die heiße Probe mit 100 ml Wasser verdünnt und in einem zweilagigen Rundfilter gefiltert, der zuvor mit heißem Wasser befeuchtet wurde. Anschließend werden Filter und Rückstände mit heißem Wasser bis zur Neutralität gewaschen. Zuletzt werden Filterpapier und Rückstand in einem Ofen für eine Stunde bei 105 °C getrocknet. Die trockenen Filter werden dann in eine Extraktionshülse überführt und zuletzt in einen 250 ml Extraktionsaufsatz gegeben (Soxhlet-Apparatur).

Der Rundkolben der Soxhlet-Apparatur (250 ml) wird mit einem Lösungsmittelvolumen aufgefüllt, das dem 1,5-fachen des Volumens des Soxhlet-Aufsatzes entspricht. Die Temperatur des Lösungsmittels Petroläther beträgt 40–60 °C. Danach wird ein Rückflusskühler aufgesetzt, das Lösungsmittel zum Sieden gebracht und das Fett über drei bis sechs Stunden extrahiert. Danach wird die verbliebene Flüssigkeit vollständig in einem Rotationsverdampfer abgedampft. Anschließend wird der geöffnete Kolben für eine Stunde bei 105 °C weiter getrocknet, um die Extraktionsflüssigkeit komplett zu entfernen. Der Kolben wird nach dem Abkühlen gewogen und der Gesamtfettgehalt bestimmt.

ISO-basierte Fettsäureumsetzung für GC-Analysen:
Das extrahierte Fett wird in einen 10 ml Rundkolben überführt und 2 ml (0,2 mol/l) Natriummethanolat in Methanol zugegeben (8 g Natriumhydroxid werden in 1.000 ml Methanol gelöst). Sieden unter Rückfluss wird durchgeführt, bis die Lösung klar ist (5 bis 20 Minuten). Die Dauer der Siedeperiode hängt von der Kettenlänge der Fettsäuren ab: Je länger die Fettsäure, desto länger dauert der Siedeprozess. Danach wird der Kolben aus der Heizquelle entnommen und zwei Tropfen Phenolphtaleinlösung werden zugefügt Schwefelsäure (1 mol/l) wird anschließend der Methanollösung zugegeben, bis die Lösung klar ist; weitere 0,2 ml werden zugefügt. Der Kühler wird erneut installiert, und die Lösung wird unter Rückfluss für fünf Minuten gekocht. Wiederum wird die Lösung von der Heizquelle genommen und in Wasser heruntergekühlt. Nach Zugabe von 4 ml einer gesättigten Natriumchloridlösung wird gut geschüttelt. Anschließend wird 1 ml n-Hexan zugegeben und der Kolben erneut für 15 Sekunden geschüttelt. Die Lösung wird stehen gelassen bis beide Phasen getrennt sind. Erneut wird gesättigte Natriumchloridlösung zugegeben, bis die wässrige Phase das untere Niveau des Flaschenhalses erreicht, etwa 2 - 3 ml. Die obere Phase enthält nun die erzeugten FAMEs.

Lebensmittelanalytik: Gesunde Fette in Chips und Würstchen?

Mikrowellenmethode – Extraktionstechnik:
0,5 g der Probe wird in ein 80 ml Glasfläschchen eingewogen und 3,5 ml Salzsäure (37 Gewichts-%), 7,5 ml Wasser und 5 ml n-Hexan zugegeben. Ein Rührfisch wird hineingegeben. Folgende Parameter werden am Discover SP-X eingestellt:

  • Endtemperatur: 115 °C
  • Rampe: 4 Minuten
  • Rührer: stark
  • Haltezeit: 15 Minuten
  • Leistung: 200 Watt

Das Lösungsmittel wird nach Aufschluss und Extraktion in eine zuvor gewogene Aluminiumschale überführt, um ein kalte Extraktion durchzuführen. Der Aufschluss im Fläschchen wird wiederum mit 5 ml n-Hexan versetzt und dann auf einem Magnetrührer für eine Minute gerührt. Danach wird die Lösung in die Aluminiumschale überführt. Diese kalte Extraktion wird drei- bis viermal wiederholt. Das Lösungsmittel mit dem extrahierten Fett wird im Heizofen für zwanzig Minuten bei 105 °C getrocknet und zuletzt die Schale gewogen. Die Berechnung des Gesamtfettgehalts erfolgt mit der folgenden Gleichung 1:F[%] = m2–m1 / E 100

m1 = Masse der leeren Schale in g

m2 = Masse der Schale mit getrocknetem Fett in g

E = Masse der Probe in g

Zur Umsetzung (MDM) werden ein oder zwei Tropfen des getrockneten Fetts in einem Glasfläschchen mit 10 ml wasserfreier methanolischer Kaliumhydroxid-Lösung (2,5 Gewichts-%) versetzt und ein Rührfisch zugefügt. Die alkalische Derivatisierung benötigt folgende Parameter im Discover SP-X:

  • Endtemperatur: 90 °C
  • Rampe: 5 Minuten
  • Haltezeit: 10 Minuten
  • Rührer: mittel
  • Leistung: 200 Watt

Nach Ende der alkalischen Umsetzung wird das Fläschchen in einem Wasserbad heruntergekühlt.14,25 ml Methanol und 0,75 ml Salzsäure (37 Gewichts-%) werden zugegeben, und eine saure Derivatisierung wird mit folgenden Parametern im Discover SP-X durchgeführt:

  • Endtemperatur: 120 °C
  • Rampe: 5 Minuten
  • Haltezeit: 6 Minuten
  • Rührer: mittel
  • Leistung: 200 Watt

Nach Umsetzungsende wird das Fläschchen in einem Wasserbad heruntergekühlt. 10 ml n-Hexan werden zugegeben, und das Fläschchen wird zweimal von unten nach oben gewendet.

Einen Überdruck zu erzeugen, muss vermieden werden. Das Glasfläschchen wird danach mit gesättigter Natriumchloridlösung bis oben gefüllt. Das Lösungsmittel muss mit einer Pipette in ein 10 ml GC-Fläschchen gegeben werden, das Natriumsulfat oder Magnesiumsulfat (ca. 0,2 g) als Trockenmittel für mögliche Wasserrückstände enthält. Diese Lösung ist nun bereit für die FAMEs-Analyse mit dem GCFID.

Lebensmittelanalytik: Gesunde Fette in Chips und Würstchen?

GC-Analyse
Um die FAMEs zu identifizieren und quantifizieren, wurde ein 37-Standard-Mix (Supelco) verwendet und in einem GC-2010 Plus AF mit FID-Detektor analysiert. Folgende Parameter wurden im GC eingestellt:

  • Injektor: SPL (Split)
  • Injektionsvolumen: 1 μl
  • Injektionstemp.: 250 °C
  • Säulentyp: FAMEWAX
  • Innendurchmesser: 0,25 mm
  • Schichtdicke: 0,25 μm
  • Detektortemperatur: 250 °C
  • Mobile Phase: Helium
  • Trägergas-Geschwindigkeit: 35 cm/sek.

Das Temperaturprogramm startet bei 130 °C mit einer Haltezeit von einer Minute. Danach wird kontinuierlich aufgeheizt mit einer Heizrate von 5 °C/Minute, bis eine Temperatur von 240 °C erreicht ist, die dann für 10 Minuten konstant gehalten wird. Die Gesamtdauer beträgt 33 Minuten.

Ergebnisse und Diskussion
Eine GC-Technik mit Flammenionisationsdetektion wurde für nahezu alle Fettsäure-FAMEs-Derivate optimiert. Von 37 im Standard-Mix vorhandenen Fettsäuren wurden 36 identifiziert. Die zwei Fettsäuren C18:1-cis und C18:1-trans konnten nicht getrennt werden, da sie koeluieren. Aber dies hat keinen Einfluss auf die Bewertung und Unterscheidung zwischen gesättigten und ungesättigten Fettsäuren, da beide koeluierenden Fettsäuren ungesättigt sind.

Abbildung 4 zeigt das Chromatogramm einer Wurstprobe mit identifizierten FAMEs, die gemäß dem ISO-Verfahren erzeugt wurden. Offensichtlich sind hauptsächlich Fettsäuren C16:0 und C18:0 vorhanden. Im Vergleich zu den Ergebnissen des ISO-Verfahrens zeigt Abbildung 5 ein Chromatogramm derselben Probe nach Anwendung des Mikrowellenverfahrens. Der Vergleich der Chromatogramme (Abbildung 4 und 5) zeigt einen signifikanten Unterschied in den FAMEs. Die Ergebnisse von C18:1-cis+cis mit Hilfe des Mikrowellenverfahrens sind signifikant höher als beim ISO-Verfahren.

Tabelle 1 zeigt, dass die Ergebnisse der ISO-Methode einen signifikanten Unterschied gegenüber der Mikrowellentechnik aufweisen. Für einen genaueren Vergleich werden die Peakflächen der gesättigten und ungesättigten Fettsäuren herangezogen und im Diagramm 1 dargestellt, das den Unterschied der Fettsäureverhältnisse in Wurstproben zwischen ISO und Mikrowellenmethode aufzeigt.

Der Vergleich beider Methoden zeigt, dass das Ergebnis an ungesättigten Fettsäuren mit der Mikrowellenmethode zehnmal höher ist als das mit der ISO-Methode. Diese erhöhten Ergebnisse bei den ungesättigten Fettsäuren konnten in gleicher Weise bei der Untersuchung anderer Nahrungsmittelproben wie Milchpulver, Schokolade und Kartoffelchips beobachtet werden, wie in Diagramm 2 dargestellt.

Der Einsatz der Mikrowellenmethode hat in allen untersuchten Nahrungsmittelproben einen höheren Anteil ungesättigter Fettsäuren zu Tage gefördert. Dies bestätigt die Hypothese, dass das neue Mikrowellenverfahren die Oxidation ungesättigter Fettsäuren im Verlauf des Prozesses verhindert und dass aus der schonenderen Bearbeitung höhere Ausbeuten resultieren, wenn der neue Mikrowellenprozess zum Einsatz kommt.

Fazit
Aussagen über Lebensmittelproben werden stetig komplexer. Für Konsumenten sind die Angaben sehr wichtig und erfordern daher eine gewisse Transparenz. Die EU-Verordnung 1169/2011 verlangt detaillierte Angaben über Nahrungsmittelproben. Am wichtigsten ist die Unterscheidung des Gesamtfetts in gesättigte und ungesättigte Fettsäuren, was für Konsumenten ein Topkriterium ist, um zwischen gesunder und ungesunder Nahrung zu unterscheiden, so dass es Gegenstand zweier Untersuchungen geworden ist. Die Bestimmung des Gesamtfettgehalts ebenso wie die von ungesättigten und gesättigten Fettsäuren ist in ISO-Normen geregelt.

Zwei Methoden wurden in dieser Arbeit entwickelt. Die erste ist ein Verfahren für den Aufschluss und die Extraktion des Gesamtfettgehalts in einem geschlossenen Mikrowellensystem und basiert auf der Weibull-Stoldt-Technik. Nahrungsmittelproben aus verschiedenen Bereichen (Milchprodukte, Genussmittel, Fleisch und Gebäck) wurden ausgewählt, und die Durchführung der Gesamtfettbestimmung mit der Mikrowellenmethode in einem geschlossenen System wurde untersucht. Es stellte sich heraus, dass dies eine universelle Methodik ist, um den Gesamtfettgehalt für unterschiedliche Lebensmittelbereiche zu bestimmen.

Die zweite Methode stimmt mit der Mikrowellenmethode überein, ebenfalls in einem geschlossenen System zur Umsetzung von Fettsäuren in FAMEs, welche dann in einem GC-FID-System analysiert werden. Der Einsatz der entwickelten Mikrowellenextraktionsmethode zeigt, dass die Technik bestens geeignet ist für die Bestimmung des Gesamtfettgehalts von Nahrungsmittelproben.

Mit der zweiten Methode wurden Lebensmittelproben auf 37 verschiedene Fettsäuremethylester analysiert. Dies ermöglicht, die DIN-Methodik für Abbau und Extraktion des Gesamtfettgehalts einer Nahrungsmittelprobe inklusive einer ISO-Technik zur Umsetzung von extrahierten Fettsäuren in FAMEs mit dem entwickelten Mikrowellenverfahren zu vergleichen, bestehend aus der Mikrowellenextraktionsmethode (MEM) und der Mikrowellenderivatisierungsmethode (MDM).

Der Fokus dieses Vergleichs besteht im Verhältnis zwischen gesättigten und ungesättigten Fettsäuren (Milchpulver, Schokolade, Wurst, Chips). Die Ergebnisse zeigen, dass das Fettsäureverhältnis zwischen ISO- und Mikrowellenverfahren unterschiedlich ist. Der Anteil ungesättigter Fettsäuren ist immer höher, wenn das Mikrowellenverfahren angewendet wird. Die höhere Ausbeuterate ungesättigter Fettsäuren bestätigt die Empfindlichkeit der ungesättigten Fettsäuren, die auf der Oxidation durch Luft und Hitzeeinfluss beruht.

Das DIN-Verfahren ist ein offenes System und benötigt Hitze über einen langen Zeitraum, was Einfluss auf die ungesättigten Fettsäuren hat (Oxidation). Das Mikrowellensystem ist ein geschlossenes System mit erheblich kürzerer Hitzeanwendung und reduzierter Oxidation von Fettsäuren. Das Mikrowellenverfahren stellt damit eine schonendere und vorzuziehende Methode dar, sofern es um ungesättigte Fettsäuren geht.

Literatur
[1] Verordnung (EU) Nr. 1169/2011 des Europäischen Parlaments und des Rates vom 25. Oktober 2011 betreffend die Information der Verbraucher über Lebensmittel und zur Änderung der Verordnungen (EG) Nr. 1924/2006 und (EG) Nr.1925/ 2006 des Europäischen Parlaments. at <http://eurlex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=OJ:L:2011:304:0018:0063:de:PDF>
[2] LFGB. Bestimmung des Gesamtfettgehalts in Fleisch und Fleischerzeugnissen – Gravimetrisches Verfahren nach Weibull-Stoldt. 3 (2014).
[3] Matissek, R., Steiner, G. & Fischer, M. Lebensmittelanalytik. (2010). doi:10.1007/978-3-540-92205-6
[4] Norm, D. Gas-Chromatographie von Fettsäuremethylestern Teil 2: Herstellung von Fettsäuremethylestern. 25 (Perinorm, 2011).
[5] Reaktionsmechanismus_Veresterung.gif (GIF-Grafik, 600 x 184 Pixel). at http://www.mn-net.com/Portals/4/images/Redakteure_Chroma/GC/Biodiesel-Reaktion-DE600.gif
[6] Veresterung_FAMES.jpg ( JPEG-Grafik, 801 x 647 Pixel). at http://www.mobilohnefossil.de/images/user/Biodiesel-Veresterung.jpg


Autoren:
Marcel Pacheco-Moreno, University of Applied Sciences
Jürgen Schram, University of Applied Sciences
Frank Scholten, CEM GmbH
Ulf Sengutta, CEM GmbH
Franz Kramp, Shimadzu Europa GmbH
Uwe Oppermann, Shimadzu Europa GmbH

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