Hochleistungsflüssigkeitschromatographie

Zwischen Notwendigkeit und Redundanz: Über die Aufbereitung von LC-Eluenten

Die moderne Hochleistungsflüssigkeitschromatographie ermöglicht sichere Identifizierung, gute Sensitivität und präzise Quantifizierung, erfordert aber dafür qualitativ hochwertige Laufmittel. Nicht nur Verunreinigungen im Spurenbereich können den Analysenerfolg gefährden, sondern auch gelöste Gase stören die HPLC-Funktionen.

Es ist hinlänglich bekannt, dass LC-Laufmittel entgast werden müssen. Warum das notwendig ist und bis zu welchem Grad gelöste Gase entfernt werden müssen, soll kurz erläutert werden: Jedes Lösungsmittel, das Kontakt zu Luft hat, kann eine bestimmte Menge an Stickstoff und Sauerstoff in sich aufnehmen. In der weit verbreiteten Reversed Phase-LC (RP) werden hauptsächlich Wasser (Eluent A) und organische Lösungsmittel (Acetonitril oder Methanol; Eluent B) verwendet. Jedes dieser Laufmittel kann für sich eine bestimmte Menge Luft lösen, wobei organische Lösungsmittel meist deutlich mehr Sauerstoff und Stickstoff aufnehmen können als vergleichsweise Wasser (Bild 1). Je geringer die Polarität des Lösungsmittels, desto größer ist die Aufnahmekapazität für die Gase der Luft.

Das Problem für die LC entsteht beim Zusammenmischen von Wasser und Organik, da die Löslichkeit der Gase Stickstoff und Sauerstoff in einer Mischung von A und B deutlich geringer ist als der Summe der einzelnen Löslichkeitsmengen entspricht.

Bild 1: Schematische Darstellung der Diskrepanz zwischen der Löslichkeit von Gas in reinem Wasser (links) bzw. purem organischem Lösungsmittel (rechts) und deren Mischungen (LM = Lösungsmittel). © Wolfgang Brodacz

Bild 1 zeigt diese Diskrepanz in einer schematischen Darstellung. Die blau-grüne Linie würde der theoretisch anzunehmenden gelösten Gasmenge entsprechen, wenn der Zusammenhang ein linearer wäre. Die Mischungen von Wasser und organischen Lösungsmitteln können aber tatsächlich nur deutlich weniger Gas „behalten“ (rote Kurve). Die Differenz (oranger Pfeil) zwischen der blau-grünen Linie und der roten Kurve entspricht der Freisetzung des nicht mehr gelösten Gases. Folglich wird das Laufmittel beim Mischen (meist am stärksten beim Verhältnis 50/50) mit Luft übersättigt, und die Luftbestandteile gasen letztlich in sehr kleinen Bläschen aus der Lösung aus. Das wiederum hat negative Folgen für den Betrieb von HPLC-Pumpen und am Ende auch im Detektor.

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Entgasen ist absolut notwendig

Kleine und sporadisch auftretende Bläschen in der Pumpe verursachen zumindest unregelmäßigen Fluss und damit Retentionszeit-Schwankungen. Im Extremfall kann die Gasmenge so groß werden, dass die Pumpenkolben nur mehr Luftpolster komprimieren und so nicht mehr in der Lage sind, genügend Druck aufzubauen, um den Eluenten durch die Säule zu transportieren.

Ausperlende Luft in einem optischen Detektor (UV, DAD, Fluoreszenz, Brechungsindex etc.) streut das Licht in der Durchflusszelle und generiert damit Rauschen, unregelmäßige Spikes oder verhindert überhaupt ein verwertbares Signal. Sauerstoff zum Beispiel kann durch sog. Quenching (teilweise Fluoreszenzlöschung) besonders die Fluoreszenz-Detektion massiv beeinträchtigen.

In diesem Zusammenhang kann dem Anwender zumindest die Unsicherheit genommen werden, dass die beim Säulenwechsel eindringende Luft die Trennsäule schädigen könnte, was manche annehmen. LC-Säulen werden mit einem geeigneten Laufmittel gefüllt und an beiden Enden verschlossen verkauft. Viele sind der Meinung, die Säule müsse nach einem Ausbau aus der LC-Anlage ganz schnell wieder dicht verschlossen werden. Sonst bestünde die Gefahr, dass die Packung durch Eindringen von Luft austrocknen und die Luft nach der Reinstallation die Partikelmorphologie beschädigen könnte. Diese Furcht ist deswegen unbegründet, weil durch die extrem engen Öffnungen der Anschlüsse (kleiner als 0,5 mm Durchmesser) nur ein sehr geringer Stoffaustausch möglich ist. Insbesondere der Diffusionswiderstand durch die sehr feinen und dicht gepackten Partikel verhindert, in Abhängigkeit von der Flüchtigkeit des Eluenten, das rasche Eindringen von größeren Luftmengen. Nur das unter Umständen am Säulenanfang langsam eindiffundierte, kleine Luftvolumen wird beim ersten Ausspülen und Equilibrieren der Säule rasch verdrängt und spielt dann bei der nachfolgenden Chromatographie keine Rolle mehr. Außerdem werden kleinere Gasmengen beim ersten Druckanstieg schnell im Eluenten gelöst und können so dem Säulenbett nicht schaden.

Entgasungsverfahren

Die einfachste Art der Entgasung ist, den Eluenten einem Unterdruck auszusetzen, was durch zusätzliches Rühren unterstützt werden kann. Einige Minuten Vakuum-Entgasung eliminiert ca. 2/3 der gelösten Gase. Das Behandeln von Lösungen mit Ultraschall hingegen entfernt nur ca. 20 – 25 %, eine Kombination aus beiden verbessert jedoch die Entgasung. Mit 80 % funktioniert die Helium-Entgasung am effizientesten, bei der teures Edelgas einige Minuten durch die Lösung perlt und die Luft austreibt [1]. Luft durch ein anderes Gas zu ersetzen erscheint auf den ersten Blick kontraproduktiv, die extrem geringe Löslichkeit von Helium macht dies aber sinnvoll (es gibt kein Gas, das sich schlechter in Wasser löst als Helium). Da die Helium-Ressourcen jedoch zur Neige gehen, ist es nach Meinung des Autors pure Verschwendung, das kostbare Edelgas zum Entgasen zu vergeuden.

Es ist aber auch gar nicht immer notwendig, die gelöste Luft vollständig auszutreiben. Letztlich genügt die Reduzierung des Gasgehaltes unter jenes Niveau, welches nach dem Mischen von Eluenten die obere Grenze der Löslichkeit darstellt. Als Faustregel gilt: Wenn die Hälfte der Gase entfernt werden kann, sollte man auf der sicheren Seite sein.

Bei einem Hochdruck-Gradientensystem sind zumindest auf der Pumpenseite auch bei weniger effizienten Entgasungsmethoden kaum Probleme zu erwarten, da sich Gase bei hohen Drücken besser lösen (man sollte aber bedenken, dass sich gegen Ende der Trennsäule der Gegendruck reduziert und in der Detektorzelle meist Normaldruck anliegt).

Bild 2: Modernes Hochdruck-UPHLC-Gradientensystem mit einem integrierten Inline-Entgaser (rot eingerahmt) für die Eluenten A und B in der Mitte über den beiden Pumpen. © Agilent Technologies

Für die weit verbreiteten Niederdruck-Gradientensysteme hat man die so genannte Inline-Entgasung entwickelt und 1984 patentiert. Aktuelle HPLC-Geräte beider Systemtypen werden in der Regel standardmäßig damit ausgeliefert. Die Platzierung des Entgasers möglichst nahe an den Pumpenköpfen (Bild 2) reduziert die Möglichkeit der Rückdiffusion von Luft durch die PTFE-Leitungen in die Eluenten und begünstigt kompakte Bauformen.

Praktische Inline-Entgasung

Inline-Entgaser (In-Line Degasser) funktionieren nach dem Prinzip einer semipermeablen Membran in Form eines Schlauches, durch den der Eluent fließt. Ähnlich einer Goretex®-Membran, die nur Wasserdampf durchlässt, können bei der Inline-Entgasung nur Gase durch die Wandung nach außen diffundieren, während die Flüssigkeit zurückgehalten wird. Um die dafür notwendige Oberfläche möglichst groß zu gestalten, wird die Entgaser-Membran als mehrere Meter langer, aufgewickelter Teflon-Schlauch mit einem Außendurchmesser von ca. 0,6 mm ausgeführt, durch den der Eluent von der LC-Pumpe angesaugt wird (Bild 3). Bei einem internen Entgaservolumen von z. B. 30 ml (älteres Entgasermodell) dauert ein Eluentenwechsel bei einem Fluss von 1 ml/min allerdings eine halbe Stunde. Eine Weiterentwicklung zum Teflon AF (Amorphous Fluoroplastic) besitzt eine wesentlich höhere Permeabilität (ca. 100-fach) für Gase und ermöglicht nun eine Reduktion der Länge auf ca. einen halben Meter. Damit sind rasche Eluentenwechsel möglich, und der Strömungswiderstand ist ebenfalls geringer.

Bild 3: Schematische Darstellung eines Inline-Entgasers (Agilent Technologies) mit der Detailansicht des semipermeablen Teflon-AS-Schlauches. © Biogeneral.com

Um die Eliminierung der abzuführenden Gase zu beschleunigen, befindet sich das Röhrenbündel in einer Vakuumkammer (violett in Bild 3). Das richtige Zusammenspiel von Membran-Porosität, Unterdruck und Verweilzeit der Eluenten gewährleistet eine automatische und ausreichende Entgasung, die idealerweise kurz vor dem Eluenten-Mischvorgang stattfindet.

Inline-Entgaser arbeiten auch ohne spezielle Wartung meist mehrere Jahre zuverlässig und werden deshalb vom Anwender oft nicht wahrgenommen. Puffer und Wasser sollte man nach Möglichkeit aber nicht über längere Zeiten in dem feinen Röhrengeflecht stehen lassen, um mikrobielles Wachstum zu vermeiden. Gegebenenfalls kann dieses Biofouling aber durch spezielle Ausspülprozeduren (z. B. mit Iso-Propanol) wieder entfernt werden, im Notfall muss das Membranmodul ausgetauscht werden.

Externe Filtration ist redundant

In manchen LC-Laboren ist es immer noch üblich, die HPLC-Eluenten mit 0,5 µm-Membranfiltern (Nylon, PTFE, Cellulose-Acetat etc.) mittels Vakuum zu filtrieren, aus Angst, sie könnten noch Partikel enthalten, welche die LC-Leitungen verstopfen würden.

Moderne HPLC-grade-Lösungsmittel und HPLC-Wasser (auch von speziellen Reinigungssystemen) sind jedoch ausreichend gut vorgefiltert. Eine zusätzliche, externe Filterung ist nicht nur aufwändig und damit teuer, sie kann auch kontraproduktiv sein, denn jede weitere, mehr oder weniger offene, Manipulation birgt die Gefahr von chemischen Kontaminationen.

So kann jeder unnötige Kontakt der hochreinen und sehr teuren Laufmittel mit Kunststoffleitungen und Filtern etc. durch Herauslösen von z. B. Weichmachern zu sog. Geisterpeaks führen. Das gilt auch für hochreine Puffer, wie sie speziell in der LC-MS notwendig sind. Üblicherweise sind feste MS-grade Puffermaterialien nicht nur rein genug, sondern lösen sich auch vollständig und partikelfrei auf, so dass auf zusätzliche Filtrationen verzichtet werden kann [2].

Der routinemäßige Austausch von internen Filtern der HPLC-Anlage bei einem ohnehin jährlich durchgeführten LC-Service wird in der Regel ausreichen, Verstopfungen durch Partikel aus Laufmitteln und Puffern zu vermeiden. Besonderes Augenmerk sollte man dabei auf den regelmäßigen Austausch der Eingangsfritten (meist 10 µm) im Laufmittel-Reservoire legen. Sie können zwar keine extrem feinen Partikel zurückhalten, sind aber ein guter Schutz gegen das Ansaugen von eventuell in wässrigen Medien wachsenden Mikroorganismen und sind kostengünstig und sehr einfach zu wechseln.

Wie überall gilt auch hier: keine Empfehlung ohne Ausnahmen. Bei Ionenpaar-Reagenzien, Puffern höherer Konzentrationen (z. B. über 5M-Natriumchlorid) oder geringer Reinheit (z. B. Phosphate, Citrate) ist es doch oft notwendig, die fertigen Lösungen auch zu filtrieren. Das gilt ganz besonders für UHPLC-Anwendungen mit Trennpartikelgrößen unter 2 µm.

Literatur:

  1. W. Dolan; “Mobile-Phase Degassing: What, Why, and How”; LCGC North America, Volume 32, Issue 7, pp. 482 – 487; 2014
  2. W. Dong; “Seven Common Faux Pas in Modern HPLC”; LC*GC Europe; S. 415 – 419; August 2014

AUTOR

Wolfgang Brodacz
AGES Lebensmittelsicherheit – Kontaminantenanalytik Linz

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