HPLC in der Ernährungswissenschaft

Fettlösliche Vitamine und Mikronährstoffe im Blut bestimmen

Autoren des Deutschen Instituts für Ernährungsforschung ­machen auf die Bedeutung der HPLC in der Ernährungswissenschaft aufmerksam. Sie beschreiben, wie sie mit der HPLC-Methode Mikronährstoffe untersuchen und auch, wie sie die Proben dafür vorbereiten.

Dr. Daniela Weber mit Blutproben an einem Hochleistungsflüssigkeitschromatographie-System zur Ermittlung fettlöslicher Vitamine und Mikronährstoffe. © Carolin Schrandt/DIfE

Der Einsatz von HPLC erlaubt mit wenig Probeneinsatz eine schnelle und kostengünstige Analyse von fettlöslichen Mikronährstoffen innerhalb eines einzigen chromatographischen Laufs. Diese Methode ist essenziell für Forschende, die an Humanstudien mit mehreren tausend Teilnehmenden arbeiten, und ist seit Jahrzehnten aus der Ernährungswissenschaft nicht mehr wegzudenken.

Zahlreiche Beobachtungsstudien lassen annehmen, dass ein hoher Obst- und Gemüsekonsum das Risiko für Erkrankungen wie Herzinfarkt, Schlaganfall, Diabetes und bestimmte Krebserkrankungen vermindert und die Lebenserwartung erhöht. Die günstigen Effekte einer pflanzenbetonten Ernährung sind u. a. auf eine höhere Aufnahme von fettlöslichen Mikronährstoffen zurückzuführen, zu denen die Vitamine A, D, E und K und Carotinoide zählen. Carotinoide sind eine Familie farblicher Pflanzeninhaltsstoffe, die Obst und Gemüse ihre rote, gelbe oder orange Farbe verleihen. Die bekanntesten Vertreter, welche auch im Plasma in nachweisbaren Konzentrationen vorkommen, sind α-Carotin, ß-Carotin, Lutein, Zeaxanthin, ß-Cryptoxanthin und Lycopin. Tabelle 1 zeigt die bedeutendsten Lebensmittelquellen für Carotinoide, Vitamin E (Tocopherole) und Vitamin A (Retinol) sowie die durchschnittlichen Konzentrationen im Blutplasma, die wir im Rahmen der großen europäischen MARK-AGE-Studie bestimmt haben. 

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Bild 1: Struktur von ß-Carotin. (Quelle: DIfE)

Chemisch gesehen bestehen Carotinoide aus einem Grundgerüst konjugierter Doppelbindungen, die acht Isoprenoideinheiten ergeben (Bild 1). Die ungesättigten aliphatischen Moleküle werden in zwei Klassen eingeteilt: die Carotine und die Xantophylle. Mitglieder der ersten Gruppe bestehen nur aus Kohlenstoff- und Wasserstoffatomen (z. B. α-Carotin, ß-Carotin und Lycopin), während die Mitglieder der zweiten Gruppe zusätzlich Sauerstoffatome enthalten (z. B. Lutein). Als Vorstufe von Retinol dienen die Carotinoide α-Carotin, ß-Carotin und ß-Cryptoxanthin. Diese werden in der intestinalen Mukosa durch ein spezielles Enzym, die ß-Carotin-Dioxygenase, in ein (α-Carotin, ß-Cryptoxanthin und weitere sehr selten vorkommende Carotinoide) bzw. zwei (nur ß-Carotin) Moleküle Retinol umgewandelt. Die meisten anderen Carotinoide besitzen keine Vitamin-A-Aktivität, gelten jedoch als wirksame Antioxidantien, ebenso wie die Tocopherole. Die antioxidative Wirkung der Carotinoide resultiert aus den konjugierten Doppelbindungen, die der Tocopherole aus einem Wasserstoffatom am Chromanolring.

Bedeutendste Lebensmittelquellen für Carotinoide, Vitamin E (Tocopherole) und Vitamin A (Retinol) sowie die durchschnittlichen Konzentrationen im Blutplasma. Quelle: PICA/* Referenz: Stuetz W, Nutrients 2016 (geometrisches Mittel aus 2.218 Studienteilnehmenden der MARK-AGE-Studie)

Analyse von Carotinoiden im Blut mittels HPLC

Die Bandbreite an Mikronährstoffen in Obst und Gemüse bestimmen wir im Blut der Teilnehmenden von Humanstudien quantitativ und können damit Rückschlüsse auf ihr Ernährungsverhalten ziehen. Mit statistischen Verfahren setzen wir die gemessenen Werte je nach Fragestellung in Zusammenhang mit dem Gesundheitsstatus, Gewicht, Alter oder mit soziologischen Aspekten, wie dem Einkommen oder der Bildung. Die gewonnenen Blutproben werden für spätere Untersuchungen in Bio-materialbanken gelagert. Carotinoide, Retinol und die Tocopherole erweisen sich erfreulicherweise bei einer – 80 °C-Lagerung im Ultratiefkühlschrank als sehr stabil. So konnte gezeigt werden, dass sich die Konzentration selbst nach fast 20 Jahren nicht signifikant verändert hat.

Die HPLC-Analyse mit gekoppelter Fluoreszenz- und UV-Detektion (HPLC-UV-FLD) stellt häufig die Methode der Wahl bei der Analyse von Carotinoiden und Tocopherolen dar, weil sie bei vergleichsweise geringem instrumentellem Aufwand eine kostengünstige Möglichkeit bietet, auch geringe Konzentrationen verschiedener Carotinoid-Isoformen unter hohem Probendurchsatz im Blut zu bestimmen. Somit bietet die HPLC-UV-FLD-Analytik von Carotinoiden eine wichtige Alternative zu einer massenspektrometrischen LC-MS/MS-Analyse.

Schema der Aufarbeitung. (Quelle: DIfE) © DIfE

Zur Probenaufarbeitung setzen wir 40 µl Plasma oder Serum ein, wobei das verwendete Probenvolumen auch reduziert werden kann. Zur Extraktion der Carotinoide führen wir eine Flüssig-Flüssig-Extraktion (LLE) mithilfe eines Ethanol-/Butanol-Gemisches (1 : 1 v/v) durch, welches gleichzeitig den internen Standard „ß-apo-8‘-carotenal-methyloxim“ enthält (Bild 2). Dieser wird eigens synthetisiert und ist durch die Reaktion von „ß-apo-8‘-carotenal“ mit o-Methylhydroxylamin-Hydrochlorid zugänglich. Nach Zugabe der Extraktionslösung vermischen wir die Proben lediglich stark und zentrifugieren sie anschließend. Den Überstand überführen wir zur Messung in Autosamplerphiolen; das Gerät zieht zur Analyse 20 µl in das HPLC-System.


Zur Analyse der sechs Carotinoide, Retinol, α- und γ-Tocopherol ist keine Derivatisierung notwendig. Retinol kann im UV-Bereich (325 nm) und über Fluoreszenz (Ex 325, Em 750 nm) detektiert werden, die Carotinoide im UV/Vis-Bereich bei einer Wellenlänge von 450 nm. Die Detektion von α- und γ-Tocopherol erfolgt bei Ex/Em 298/328 nm (Bild 3).

Bild 3: Chromatogramme einer Plasmaprobe. Quelle: DIfE

Die mobile Phase setzt sich aus Acetonitril (82 % v/v), 1,4-Dioxan (15 % v/v) und Methanol (3 % v/v) zusammen. Bei isokratischer Elution mit einer Säulentemperatur von 40 °C und einer Flussrate von 1,5 ml pro Minute eluieren die sechs Carotinoide, Retinol und die beiden Tocopherole innerhalb von 13,5 Minuten. Die verwendete Säule ist eine C18-Säule mit den Dimensionen 250 x 4,6 mm und einer Partikelgröße von 3 µm.

Die Inter-batch-Variationskoeffizienten liegen bei < 6 % für Retinol, α-Tocopherol und ß-Carotin, bei < 10 % für die Carotinoide und γ-Tocopherol. Die verschiedenen Lycopin-Isomere sind im Plasma als „Treppe“ zu sehen. Dabei werden die Lycopin-Isomere nicht einzeln, sondern als Summe bestimmt.

Unveröffentlichte Ergebnisse unserer Abteilung zeigen, dass Serum-Konzentrationen derselben Personen um ca. 10 % höher sind als die Plasma-Konzentrationen (Bild 4). Dies gilt es zu beachten, wenn man Literaturwerte miteinander vergleicht.

Bild 4: Vergleich Serum vs. Plasma von vier Probanden. Quelle der Diagramme: DIfE

Unsere Ergebnisse zeigen zudem, dass sich die Konzentrationen dieser fettlöslichen Mikronährstoffe auch zwischen verschiedenen Ländern stark unterscheiden. Beispielsweise ist die Konzentration von Lycopin in Belgien im Mittel viel höher als in den Nachbarländern. Schaut man sich die Ernährungsgewohnheiten genauer an, könnte man vermuten, dass es am belgischen Nationalgericht Pommes frites bzw. am dazugehörigen Ketchup liegt. Des Weiteren beobachteten wir, dass – bei gleichen Ernährungsgewohnheiten – einzig Lycopin invers mit dem Alter assoziiert ist. Dies führte uns zu der Theorie, dass die Bioverfügbarkeit dieses Carotinoids im Alter eingeschränkt sein könnte. Aktuell untersuchen wir das an jungen und älteren Teilnehmenden der BioMiEL (Bioavailability of Micronutrients in Elderly)-Studie im Rahmen des Kompetenzclusters NutriAct.

Weiterführende Literatur und Hintergrundinformationen:

Thema „Inverse Assoziation zwischen dem Alter und Lycopin-Status (MARK-AGE-Studie)“ in: Wolfgang Stuetz, Daniela Weber et al.: Plasma Carotenoids, Tocopherols, and Retinol in the Age-Stratified (35–74 Years) General Population: A Cross-Sectional Study in Six European Countries; Nutrients 2016; Nutrients 2016, 8(10), 614; https://doi.org/10.3390/nu8100614

Thema „Frailty-Syndrom steht im Zusammenhang mit verringertem Mikronährstoffstatus (Frailomic-Studie)“ in: Kochlik, B., Stuetz, W., Pérès, K., Pilleron, S., Féart, C., García, F.C.G., Bandinelli, S., Gomez-Cabrero, D., Rodriguez-Mañas, L., Grune; T., Weber, D.: Associations of fat-soluble micronutrients and redox biomarkers with frailty status in the FRAILOMIC initiative. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle 2019, DOI: 10.1002/jcsm.12479

Thema „Medikamenteneinnahme führt zu verändertem Mikronährstoffstatus (MARK-AGE-Studie)“ in: Daniela Weber, Bastian Kochlik et al., Medication Intake Is Associated with Lower Plasma Carotenoids and Higher Fat-Soluble Vitamins in the Cross-Sectional MARK-AGE Study in Older Individuals; J. Clin. Med. 2020, 9(7), 2072; https://doi.org/10.3390/jcm9072072

Thema „Inverse Assoziation zwischen Alter und Lycopin-Status – unabhängig von der Ernährung (Berliner Altersstudie II)“ in: Plasma carotenoids, tocopherols and retinol - Association with age in the Berlin Aging Study II; Daniela Weber, Bastian Kochlik et al.; Redox Biology, Vol. 32, May 2020; https://doi.org/10.1016/j.redox.2020.101461

AUTOREN

Dr. Daniela Weber und Thorsten Henning
Abteilung Molekulare ToxikologieDeutsches Institut für Ernährungsforschung Potsdam-Rehbrücke (DIfE)

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