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Fraktionen nahtlos verpacken und mehrMeine HPLC tropft

Fraktionen nahtlos verpacken und mehr: Meine HPLC tropft

Koppelt man die hochdruckstabile Chip-HPLC an die Tröpfchenmikrofluidik, entsteht eine neue Technologie. Sie vereint die mikrofluidische Welt der Trenntechniken mit der Welt der Tropfenmikrofluidik.

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StabilisotopenverdünnungsanalytikMaximierung der Probenaufgabevolumen in LC und GC

Die Forderung nach immer nachweisstärkeren chromatographischen Methoden nimmt neben der Selektivitäts- und Sensitivitätssteigerung auf der Detektorseite auch die Probenaufgabe stärker in die Pflicht. Die Steigerung des Injektionsvolumens in der HPLC und GC verbessert nicht nur die Sensitivität einer Methode, sondern erhöht bei Verwendung von isotopenmarkierten internen Standards auch die Wirtschaftlichkeit der Stabilisotopenverdünnungsanalytik SIVA. Eine simple Erhöhung des Aufgabevolumens kann jedoch auch zu Problemen mit der Peakform und zu Systemüberlastungen führen.

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Stabilisotopenverdünnungsanalytik: Maximierung der Probenaufgabevolumen in LC und GC

Maximierung des LC-Injektionsvolumens
Die Maximierung des Probenaufgabevolumens in der HPLC bringt, abgesehen von der gesteigerten Nachweisempfindlichkeit, auch eine bessere Nutzung der oft wertvollen oder raren Probenmenge. Das ist auch von besonderer Bedeutung, wenn teure isotopenmarkierte Standards im Laufe der Aufarbeitung als interne Standards zugemischt werden müssen.

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Als Anhaltspunkt für die optimale Aufgabenmenge gibt es verschiedene Richtlinien, denn die Überschreitung dieser Grenzen muss mit gestörten bzw. verbreiterten Peakformen bezahlt werden [1]. Grundsätzlich trägt jede Probenaufgabe zur Bandenverbreiterung bei. Um diese möglichst gering zu halten, sollte aus rein chromatographischer Sicht das Injektionsvolumen eigentlich minimiert werden. Der resultierende Zielkonflikt muss mit der Tolerierung eines bestimmten Bodenzahlverlustes gelöst werden.

Als grober Anhaltspunkt für die am weitesten verbreitete Reversed Phase-LC (RP; C-18) kann z.B. die Faustregel von Prof. Welsch [2] gesehen werden. Seine Abschätzung des Probenvolumens geht von einer Säule mit ca. 10 000 Böden aus und nimmt eine Reduktion der Bodenzahl von ca. 10 % in Kauf:

Injektionsvolumen (µl) = 5 x Retentionszeit (min) x Flussrate (ml/min)

Bei einer Erhöhung des Injektionsvolumens von 20 µl, auf z.B. 80 µl, steht einer Verbesserung der Sensitivität um den Faktor 4 eine Reduktion der Auflösung um ca. 26 % gegenüber (Säule: 125 x 4 mm; 5 µm; 1 ml/min).

Hauptkriterium Elutionsstärke
Trotz aller Regeln und Richtlinien kommt man bei der Methodenentwicklung um eine empirische Optimierung nicht herum. Dabei wird manchmal übersehen, dass die Zusammensetzung der Probenlösung im Verhältnis zum Eluenten von besonderer Bedeutung ist.

Entscheidend ist die Elutionsstärke, und damit ist in der RP-Chromatographie der organische Anteil am Injektionsvolumen ausschlaggebend. Wenn die Zusammensetzung der Probe bei isokratischen Trennverfahren der des Eluenten, bzw. bei Gradientenverfahren der des Anfangsgradienten, entspricht, sind diesbezüglich keine Probleme zu erwarten. In solchen Standardfällen können die üblichen Injektionsvolumen auch ohne besondere Einschränkungen verwendet werden.

Ist der organische Anteil der Probe deutlich geringer als der des Eluenten, so ist die Probenlösung "chromatographisch schwächer" und es darf das Injektionsvolumen sogar etwas erhöht werden, ohne die chromatographische Trennung gravierend zu stören (teilweise Aufkonzentrierung der Analytenzone am Säulenkopf). In der überwiegenden Anzahl der Fälle handelt es sich in der RP-LC beim organischen Anteil um Methanol oder Acetonitril (selten Iso-Propanol, Ethanol oder Tetrahydrofuran). Bei kritischen Trennungen sollte übrigens beachtet werden, dass Acetonitril eine um ca. 10 % höhere Elutionskraft besitzt als Methanol.

Ist die Probe aber stärker, d.h. der relative Anteil an nichtwässrigen, unpolaren Komponenten ist höher als im Eluenten, muss das Injektionsvolumen entsprechend reduziert werden. Denn durch die lokale Überladung der Säule werden die Peaks proportional zum Injektionsvolumen verbreitert.

Bei einem Gradientensystem wirken sich diese Zusammenhänge noch deutlicher aus, denn Gradienten beginnen meist mit einem sehr geringen organischen Anteil von z.B. 10 %. D.h. der hohe Wasseranteil während der Injektionsphase erfordert eine entsprechend "schwache" Probenzusammensetzung oder eine Reduktion des Injektionsvolumens, wenn aus bestimmten Gründen ein hoher organischer Anteil notwendig sein sollte.

Die Missachtung dieser einschränkenden Zusammenhänge trifft in erster Linie die früheluierenden Analyten in Form von Peakverbreiterungen bis zu massiven Deformationen, so dass die erste Substanz manchmal gar nicht mehr als Peak erkannt werden kann. Es ist einleuchtend, dass der Analyt mit der geringsten Retention am stärksten unter der höheren Elutionskraft des injizierten Volumens "leidet".

Bei der LC-Methodenentwicklung muss daher als erstes die Frage geklärt werden: In welcher Lösungsmittel-Zusammensetzung muss oder soll meine Probe anfallen?

Abhängig von der Probenvorbereitung können sich fixe Vorgaben durch Extraktionsmittel, Eluentenzusammensetzung des Clean-up-Verfahrens, etc. ergeben, so dass der Spielraum für eine gewünschte Zusammensetzung der Messlösung mehr oder weniger eingeschränkt wird. Bei vordefinierter Zusammensetzung der Messlösung kommt nur noch die experimentelle Ermittlung des maximalen Injektionsvolumens in Frage. Mit steigendem organischen Anteil wird dieses ungünstiger Weise entsprechend kleiner ausfallen müssen.

Besteht bei der Gestaltung der Zusammensetzung genügend Spielraum, sind im Vorfeld die folgenden Fragestellungen zu klären:

  • Welcher organische Minimalanteil ist notwendig, um alle meine Zielanalyten noch sehr gut zu lösen (ohne dass sie z.B. beim Abkühlen an der Gefäßwand ausfallen, etc.)?
  • Welche Zusammensetzung ergibt sich bei einer Minimierung von manuellen Verfahrensschritten bei der Aufarbeitung (d.h. Vermeidung von Konzentrierungen, Lösungsmittelwechsel, etc.)?

Aus der resultierenden Bandbreite sollte man sich an der chromatographisch schwächeren Seite orientieren, damit das Aufgabevolumen möglichst wenig eingeschränkt werden muss.

Injektionsvolumen versus Peakbreite
Am folgenden Praxisbeispiel der Entwicklung einer Mykotoxin-Multimethode sollen die Auswirkungen abgestufter Messlösungs-Zusammensetzungen bei verschiedenen Injektionsvolumen auf die Peakform der Früheluierenden demonstriert werden. (Aus Gründen der Anschaulichkeit sind nur die ersten vier Peaks dargestellt. Die später eluierenden Peaks sind praktisch nicht mehr betroffen).

Für die LC-Injektionsmaximierung wurden aus Literaturangaben praxisnahe Spannweiten ausgewählt, wie in Tab. 1 angegeben miteinander kombiniert und dann experimentell getestet. Die Konzentrationen der Analyten wurden in den zehn abgestuften Messlösungen so gestaltet, dass bei jeder Injektion die gleiche Absolutmenge an Analyten aufgegeben wird. Dadurch ergeben sich gleiche Peakflächen, und Verbreiterungseffekte können zusätzlich leichter an den reduzierten Peakhöhen erkannt werden.

Der Gradient aus Eluent A (10 % Methanol in Wasser) und Eluent B (97 % Methanol in Wasser) startet zwei Minuten lang nur mit dem wässrigen Laufmittel A und steigert dann innerhalb von 12 min den organischen Eluenten B von 0 auf 100 %. Die zeitgesteuerte Mischung wurde mit 1 ml/min auf eine RP-Säule (C-18; 150 x 4,6 mm; 5 µm) gebracht, der Eluentenzusatz von 1% Essigsäure und 5mM Ammoniumacetat dient in beiden Laufmitteln der Elektrospray-Ionisierung im Triple-Quadrupol-Massenspektrometer [3].

Die Chromatogramme in Bild 1 repräsentieren verschiedene Injektionsvolumen bei einer Probenzusammensetzung von 50 % Acetonitril/50 % Wasser. Bei diesem Beispiel für einen relativ hohen organischen Anteil zeigen sich ab einem Volumen von 5 µl massive chromatographische Störungen des polaren Ersteluierenden NIV (Nivalenol). Bei 10 µl ist auch schon DON (Desoxynivalenol) betroffen und ab 20 µl kommt es bei den ersten drei Peaks zu starken Deformationen.

Als Beispiel für einen mittleren organischen Anteil (20 % Acetonitril/80 % Wasser) sind vier steigende Injektionsvolumen in Bild 2 gegenübergestellt. Während 10 µl noch gute Peakformen zeigen, hinterlassen größere Aufgabenmengen von Acetonitril zunehmende Peakdeformationen beim gering retardierten NIV. Die lokalen Überladungen wirken sich bei 20 % organischem Anteil aber nicht mehr auf den zweiten Peak aus.

Die jeweils empirisch ermittelten maximalen Injektionsvolumen der unterschiedlichen Messlösungszusammensetzungen ("best of") sind in Bild 3 gegenübergestellt. Dabei wird deutlich, dass bei 50 % Acetonitril selbst die Reduktion auf 5 µl noch nicht ausreicht, um NIV sauber zu chromatographieren.

Für die Praxis wird schließlich eine Probenlösung mit 10 % Acetonitril in Wasser gewählt und daraus werden 40 µl (entspricht dem Maximalvolumen des verwendeten Autosamplers) injiziert. Diese Lösung entspricht in ihrer Elutionskraft etwa dem Anfangseluenten A.

Bei guten symmetrischen Peakformen wird damit ein Maximum an Probenaliquot ausgenutzt und in die Nachweisempfindlichkeit investiert. Noch wichtiger kann in der Praxis die eventuell damit erreichte Vermeidung eines Konzentrierungsschrittes bei der Aufarbeitung sein.

„Large Volume Injection“ in der GC
In der Gaschromatographie lösen die Optimierung der klassischen Splitless-Injektion bzw. speziell für die "Large Volume Injection" daraus weiterentwickelte Probenaufgabesysteme die Probleme mit übermäßigen Bandenverbreiterungen und verbessern entscheidend die Nachweisempfindlichkeit und Nutzung des Probenvolumens.

Splitless-Druckpuls-Injektion
Die Splitless-Injektion ist der Klassiker in der nachweisstarken GC, wird aber meist nur mit 1...2 µl durchgeführt. Mit der Druckpuls-Injektion und etwas höher siedenden Lösungsmitteln lässt sich das einfach und robust auf zumindest 5 µl steigern.

Der übliche Gasfluss während der Splitless-Dosierung durch den Liner bedingt einen relativ langsamen Transfer der Probe in die Säule. Besonders bei labilen Analyten besteht durch die lange Kontaktzeit mit dem heißen Injektor die Gefahr von Zersetzungen. Moderne GC-System sind praktisch alle mit einer elektronischen Drucksteuerung (EPC, "Electronic Pneumatic Control") ausgestattet. Damit wird zeitgesteuert der Säulenvordruck für die Injektionsphase wesentlich erhöht. Mit dem Druck-Puls werden die Analyten wesentlich rascher in die Säule "gedrückt" und damit die Zersetzungsgefahr vermindert.

Da nach der allgemeinen Gasgleichung das Dampfvolumen umgekehrt proportional dem Umgebungsdruck ist, besteht auch die Möglichkeit, mit dem gesteigerten Vordruck das entstandene Dampfvolumen zu reduzieren. So kann mehr verdampfte Probe in das Injektorsystem gepresst werden.

Bei der Druckpuls-Injektion kann so das Injektionsvolumen deutlich gesteigert werden, bevor das interne Volumen des Liners ausgeschöpft ist. Agilent Technologies bietet im Internet den "Solvent Vapor Volume Calculator" zum kostenlosen Download an [4]. Damit kann das entstehende Dampfvolumen bequem für alle Lösungsmittel (frei erweiterbar) und GC-Parameter bestimmt und somit das maximale Injektionsvolumen für definierte Linergrößen ermittelt werden.

Die Substitution von leichtflüchtigen Lösungsmitteln (z.B. n-Hexan, Petrolether) durch höher siedende Varianten gleicher Polarität (iso-Oktan, n-Decan) erlaubt weitere Steigerungen des Injektionsvolumens. Dabei wirkt sich gemäß der allgemeinen Gasgleichung auch das höhere Molgewicht noch einmal positiv aus [5].

Nach eigenen Erfahrungen konnte bei praktisch allen rückstandsanalytischen Methodenentwicklungen das Injektionsvolumen von meist 1 µl auf zumindest 5 µl gesteigert werden. Bild 4 zeigt den Druckverlauf einer optimierten Splitless-Injektion. Der Druckanstieg in der Ausheizphase hilft die Säule rascher von spät eluierenden Verunreinigungen zu befreien.

Damit der Chromatographieprozess trotz der unvermeidlich breiten Anfangsbanden im GC-Injektor mit möglichst schlanken Substanzprofilen beginnt, müssen die Analyten am Säulenanfang durch Rekonzentrierungseffekte fokussiert werden. Dazu sollten sie während des Probentransfers im Idealfall am Beginn der ofenthermostatisierten Säule gestoppt werden. Das kann durch Absenken der Säulentemperatur beim sog. "Cold Trapping" [6] und/oder durch temporäre Erhöhung der Filmdicke unter Verwendung des Lösungsmittels als stationäre Phase im Rahmen des sog. "Solvent-Effektes" [7] erreicht werden.

Programmed Temperature Vaporizer
Während die Splitless-Injektion trotz Druckpuls normalerweise mit 5...10 µl an ihre Grenzen stößt, erlaubt der daraus weiterentwickelte "Programmed Temperature Vaporizer" (PTV) Probenaufgabevolumen von 100 µl und im Einzelfall auch deutlich darüber. Ein PTV-Injektor ist aufgebaut wie ein Splitless-Injektor, der prinzipielle Unterschied betrifft jedoch den extrem schnell aufheizbaren und kühlbaren Liner geringer thermischer Masse (Bild 5) und die nichtverdampfende Probenaufgabe in den kalten Injektor.

Die Dosierung der flüssigen Probe erfolgt in ein Verdampferröhrchen, das mit silanisierter Glaswolle gefüllt sein kann, oder es wird ein Liner mit sog. Verwirbelungseinstichen (Einbuchtungen zur Vergrößerung der Oberfläche; "Baffled Liner" in Bild 6) eingesetzt. Für größere Volumina gibt es spezialisierte Sonderformen.

Da anfangs die Injektortemperatur unter dem Siedepunkt des Lösungsmittels gehalten wird, kann die gefürchtete Nadeldiskriminierung ausgeschlossen werden. Bei der sog. Nadeldiskriminierung verdampfen die Leichterflüchtigen in höherem Ausmaß aus der Nadel heraus, als ihrer Zusammensetzung in der Flüssigkeit entspricht. Dadurch werden die Schwererflüchtigen diskriminiert.

Erst mit dem sehr schnellen Aufheizen des Liners (mit z.B. 700 K/min auf bis zu 450 °C) gelangen die flüchtigen Zielanalyten wie bei der splitlosen Injektion in die Säule, um dort wiederum fokussiert zu werden.

PTV mit Lösungsmittelausblendung
Die flexible Programmierbarkeit von Injektortemperatur und Gasfluss erschließt beim PTV mit EPC die vielfältige Möglichkeiten der sog. Lösungsmittelausblendung ("Solvent Vent").

Liegt die Probe in einem Lösungsmittel vor, welches im Vergleich zum flüchtigsten Analyten sehr leicht verdampfbar ist, so kann einer der größten Schwachpunkte verdampfender Injektoren, nämlich die Diskriminierung leichtflüchtiger Substanzen, gezielt zur Eliminierung des Lösungsmittels eingesetzt und zum Vorteil umgemünzt werden. Dazu wird der Liner während der Dosierung so temperiert, dass das Lösungsmittel schon gut abdampft, die Zielanalyten jedoch noch keine relevante Flüchtigkeit zeigen. (Als grober Richtwert können ca. 30 K unter dem Siedepunkt des Lösungsmittels angenommen werden).

Der Säulenvordruck ist während dieser Lösungsmittelausblendung auf Umgebungsdruck reduziert, damit der Lösungsmitteleintrag in die Säule so gering wie möglich ist.

Ein hoher Spülgasfluss (ca. 100...500 ml/min) durch den Liner ins Freie sorgt hingegen für eine rasche Eliminierung des Lösungsmitteldampfes (Bild 6, gelb). Das Split-Ventil wird erst kurz vor dem rapiden Aufheizen des Liners geschlossen, um die aufkonzentrierten Analyten (blau) der Trennsäule zuzuführen, wo sie bei abgesenkter Ofentemperatur durch Cold Trapping fokussiert werden.

Das kleine interne Volumen aller PTV-Liner erfordert insbesondere bei größeren Injektionsmengen eine sehr sorgfältige Optimierung von Linertemperatur, Gasfluss und besonders der Dosiergeschwindigkeit. Es darf pro Zeiteinheit nur jenes Volumen nachdosiert werden, welches auch dampfförmig durch den Gasstrom aus dem Liner abgeführt werden kann. Spezielle Injektionssysteme mit programmierbaren kontinuierlichen Dosiergeschwindigkeiten erlauben die Aufgabe mehrerer hundert Mikroliter.

Der Zielkonflikt besteht dabei in der Optimierung der Analyten-Rückgewinnung bei gleichzeitig hoher Effizienz der Lösungsmittel-Ausblendung. Zur Unterstützung der Recovery ist eine Kühlung mit Flüssig-CO2(-60 °C) oder Flüssig-N2(-160 °C) vorgesehen.

Mit elektronischen Druck- bzw. Fluss-Steuerungen wird nur für die Solvent-Vent-Phase der Gasstrom stark erhöht, während man in der wesentlich längeren Chromatographie-Phase gezielt teures Helium einsparen kann ("Gas Saver").

Da bei hohen Gasflussraten in Abhängigkeit von der Temperatur aber auch die Gefahr von Analytverlusten steigt, ist diese Technik nur bei genügend großem Flüchtigkeitsabstand zwischen Lösungsmittel und Analyten möglich. Die Siedepunkte von Lösungsmittel und der flüchtigsten Zielkomponente sollten sich mindestens um 100 K unterscheiden.

Zusätzliches Aufheizen ("Ausbacken") des PTVs nach dem Probentransfer, kombiniert mit hohen Flussraten im Split-Modus, kann zur thermischen Reinigung des Liners beitragen.

Bild 7 zeigt schematisch die Verläufe von Temperatur, Druck und Gasfluss während einer PTV-Probenaufgabe mit Lösungsmittel-Ausblendung. Die unterbrochenen Linien entsprechen den Verlaufsänderungen beim zusätzlichen thermischen Reinigen des Liners.

Ausgestanzte Septumkrümel im Verdampferröhrchen sind im PTV-Liner besonders störend und unbedingt zu vermeiden. Manche PTVs sind daher mit einem septumlosen Aufgabekopf erhältlich, welcher einem speziellen Ventil entspricht, das von der Spritzennadel geöffnet und geschlossen wird (Bild 5, grün).

Der experimentelle Aufwand zur Systemoptimierung lohnt sich nicht nur, wenn durch den PTV die erforderliche Nachweisempfindlichkeit erreicht oder wesentlich verbessert wird, sondern auch, wenn es gelingt, den fehleranfälligen und aufwändigen manuellen Einengungsschritt der üblichen Messlösungskonzentrierung völlig in den Injektor zu transferieren. Die automatisierte Anreicherung ist reproduzierbarer und kostengünstiger.

Fazit
Die Anwendung von "Large Volume Injection"-Techniken sind eine Möglichkeit, die Nachweisempfindlichkeit in der GC wesentlich zu verbessern u./od. den Verbrauch teurer isotopenmarkierter Standards bei SIVA-Methoden zu reduzieren. Zusätzlich kann das manuell aufwändige und fehleranfällige Konzentrieren von Messlösungen in das GC-System transferiert und automatisiert werden. Die PTV-Injektion verbindet die Robustheit der Splitless-Technik mit der Möglichkeit zur Ausblendung von Lösungsmittel und ist daher ideal für schwerflüchtige Analyten geeignet.

In der LC wird das Probenaufgabevolumen vom Anteil des organischen Lösungsmittels limitiert. Je geringer die Elutionsstärke der Messlösung ist, desto mehr kann injiziert werden. Bei der Gradientenelution sind die früheluierenden Analyten besonders stark betroffen und daher kritisch zu prüfen.

Literatur

  1. Alsehli, J. W. Dolan, "The Role of the Injection Solvent"; LC*GC Europe; S 564-568; October 2012.
  2. Welsch, "Packungstechnologie und Säulendesign für hohe Auflösung, Geschwindigkeit und Massenempfindlichkeit in der HPLC"; Institut für Analytische und Bioanalytische Chemie, Universität Ulm; 27. Agilent Forum Analytik; Wien 2011.
  3. M., Berthiller F., Krska R., Schuhmacher R., "Development and validation of a liquid chromatography/tandem mass spectrometric method for the determination of 39 mycotoxins in wheat and maize", Rapid Commun. Mass Spectrom. 20, 2649-2659, 2006.
  4. http://www.chem.agilent.com/en-US/Technical-Support/Instruments-Systems/Gas-Chromatography/utilities/Pages/GCPressureFlowCalculatorPCRev205.aspx.
  5. Brodacz, "Lösungsmittelauswahl in der GC"; LaborPraxis, S14-19, September 1998.
  6. Grob, "Classical Split and Splitless Injektion in Capillary GC", Hüthig, Heidelberg - Basel - New York (1986).
  7. Grob, "On Column Injection in Capillary Gas Chromatographie - Basic Technique, Retention Gaps, Solvent Effects;" Hüthig, Heidelberg - Basel - New York (1987).

Wolfgang Brodacz

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