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FachbeitragLab-on-a-Chip

Nanotechnologie für die In-vitro-Diagnostik

Manabu Abe*)

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Fachbeitrag: Lab-on-a-Chip

*) Institut für Klinische Chemie und Laboratoriumsmedizin, Klinikum Stuttgart Katharinenhospital. E-Mail: m.abe@klinikum-stuttgart.de

Nanotechnologien ermöglichen auf kleinstem Raum chemische Analysen von Proben vorzunehmen, für die normalerweise ein voll ausgestattetes Labor nötig wäre (Lab-on-a-Chip). Geringste Mengen von Körperflüssigkeiten reichen aus, um verschiedene diagnostische Messungen parallel durchzuführen. Lab-on-a-Chip-Verfahren setzen auf die Möglichkeit, schnell und dezentral eingesetzt werden zu können, ohne hoch spezialisierte Laboratorien vor Ort zu benötigen (Point of Care Testung = patientennahe Labordiagnostik).

Unter Labs-on-a-Chip (LOCs) versteht man miniaturisierte Laboratorien, in denen komplexe chemische Messungen durchgeführt werden. Gemäß des analysierten biologischen Materials können dabei drei Anwendungsbereiche unterschieden werden: die Analyse von DNA, Proteinen (Enzyme, Antikörper usw.) und Zellen. Die Besonderheit der LOCs besteht darin, dass Flüssigkeiten und Chemikalien in Kanälen und Reaktoren gehandhabt werden, deren Breite nur einige 1 bis 100 µm beträgt. In solch schmalen Kanälen weisen Flüssigkeiten laminare Strömungsprofile auf, und ihre Durchmischung erfolgt im Wesentlichen durch Diffusionsprozesse, die im Vergleich zur turbulenten Mischung sehr viel langsamer sind. Das Wissenschaftsfeld, das sich mit der Handhabung von Flüssigkeiten, wie Transport, Mischung und Trennung, unter solchen Bedingungen beschäftigt, ist die Mikro- bzw. Nanofluidik. Ihr kommt in der LOC-Technologie eine besondere Bedeutung zu (Bild 1).

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Aufgrund der Miniaturisierung und dem monolithischen Aufbau weisen LOCs im Vergleich zur herkömmlichen Labortechnik entscheidende Vorteile auf, die sich folgenderweise zusammenfassen lassen:

- Geringe Totvolumina und reduzierter Reagenzienverbrauch.

- Monolithischer Aufbau ermöglicht billige Massenfabrikation.

- Die Mikrofluidik führt zu einem verbesserten Masse- und Wärmetransfer. Dadurch können Reaktionsbedingungen präziser gesteuert und höhere Ausbeuten erreicht werden.

- Der Zeitbedarf für Analysen kann durch die Parallelisierung von Arbeitsprozessen drastisch reduziert werden.

Herstellung und Funktionselemente

Die Verfahren, mit denen LOCs hergestellt werden, sind vielfach aus der Mikrostrukturtechnik entliehen. Als Materialien werden hauptsächlich Glas, Silizium und verschiedene Polymere, wie Polydimethylsiloxan, Polycarbonat und Teflon, verwendet. Zu den wichtigsten Herstellungsmethoden zählen Photo- und Soft-Mikrolithographie sowie Formtechniken und Mikrofabrikationsverfahren, die Laser oder elektrochemische Reak­tionen nutzen. Die Schnittstelle zwischen der Laborwelt und dem LOC ist die Probeninjektion. Die Proben werden entweder über eine Kapillare oder über einen Druckgradienten in den Chip eingesogen. Weiterhin besteht die Möglichkeit, Mikropipetten für die Injektion zu verwenden.

Innerhalb des Chips kann der Transport der Flüssigkeiten z.B. durch einen Druckgradienten erfolgen oder über elektroosmotische Prozesse. Bei letzteren wird ausgenutzt, dass die Oberflächen der mikrofluidischen Kanäle immer eine gewisse Ladung aufweisen, die in Gegenwart einer Flüssigkeit zur Ausbildung einer elektrischen Doppelschicht führen. Wird eine Spannung angelegt, so bewegt sich die Flüssigkeit aufgrund dieser Doppelschicht in die durch die Polung der Spannung vorgegebene Richtung. Um Flüssigkeiten miteinander zu mischen, werden die Kanalwände strukturiert, so dass turbulente Strömungsmuster erzeugt werden.

Zur Auftrennung geladener Moleküle, wie z.B. DNA, können Elektrophorese-Techniken angewandt werden. Dabei werden DNA-Bruchstücke entlang eines elektrischen Gradienten durch ein Gel "gezogen". Da die Wandergeschwindigkeit der Fragmente abhängig von ihrer Größe ist, wird hiermit eine Auftrennung der Probe erreicht. Um Reak­tionen in den mikrofluidischen Systemen zu kontrollieren, kann z.B. die Reaktionszeit über die Geschwindigkeit, mit der die Flüssigkeiten durch die Reaktionskammer strömen, eingestellt werden. Weiterhin besteht die Möglichkeit, die Temperatur des Reaktors über Mikroheizelemente und -sensoren zu steuern [1].

Anwendungen

LOCs können für viele Bereiche in der Forschung und Diagnostik eingesetzt werden, die auch schon für Protein- und DNA-Chips angewendet worden sind. Im Folgenden sind die drei wichtigsten Anwendungsfelder noch einmal aufgeführt:

- Integrierte und automatisierte Probenaufbereitung für DNA- und Proteinchips.

- Untersuchung und Manipulation von Zellen, wie z.B. das Sortieren, Reinigen und Klonieren von Zellen.

- Langfristig wird für LOCs auch ein großes Anwendungspotenzial im Bereich der Point-of-Care-Testung (POCT) gesehen, insbesondere für die Diagnose von Krankheiten und Krankheitserregern sowie in der Pharmakogenetik.

Limitierungen und Trends

Die Mikrofluidik ist eine der Kerntechnologien, ohne die der Aufbau von LOCs nicht möglich ist. Eines der verbleibenden Probleme der LOC-Fluidik ist die Tendenz von Biomolekülen, sich an den Wänden der Kanäle abzulagern. Es ist daher von hohem Interesse, die fluidischen Systeme so weiterzuentwickeln, dass ein Transport der Bio­moleküle ohne Wandkontakt möglich ist. Um dies zu erreichen, kann mit einer so genannten hydrodynamischen Fokussierung gearbeitet werden, bei der die Probe röhrenförmig von einer Schutzflüssigkeit umhüllt ist. Eine weitere Herausforderung in der LOC-Technik ist die Positionierung des biologischen Materials mit nanoskaliger Genauigkeit, wie es für bestimmte Nachweismethoden notwendig ist [2].

Aufgrund der sehr breit gefächerten Anwendungsmöglichkeiten der Labs-on-a-Chip (LOCs) gibt es eine Vielzahl von Möglichkeiten, mit Hilfe von Nanotechnologie diese Systeme mit neuen Funktionalitäten auszustatten, wie z.B. Oberflächenstrukturierun­gen, Detektionssysteme, Nanoporen oder nanoskalige Aktuatoren. Anwendungsbeispiele aus dem Bereich der DNA- und Proteinchips lassen sich dabei zum Teil auf die Labs-on-a-chip übertragen.

Detektionsmethoden

Für die Detektion von Biomolekülen in LOCs sind eine Reihe von Verfahren angewandt worden, wie Fluoreszenzmethoden, Massenspek­trometer und elektrochemi­sche Methoden. Bei den Fluoreszenzmethoden wird ein analoges Verfahren genutzt, wie in der DNA-Chip-Technologie, das heißt, die Probemoleküle müssen vor der Detektion mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert werden.

Rastersonden­mikroskope

Die Entwicklung des Raster-Tunnel-Mikroskops und des Atomic-Force-Mikroskops (AFM) waren Auslöser der Entwicklung des Forschungsgebietes der Nanowissenschaften. Rastermikroskope tasten Oberflächen punktweise ab und erlauben so die Herstellung von Bildern mit enormer Auflösung bis hinunter zum Einzelatom. Ursprünglich vor allem für physikalische Experimente verwendet, hat der Einsatz dieser hochauflösenden Mikroskope einen wertvollen Platz in der biomedizinischen Bildgebung erhalten. Die Verwendung von hochempfindlichen Sen­soren auf der Basis der AFM-Technologie gewinnt für die an der Oberfläche ablaufenden Prozesse in der medizinischen Diagnostik zunehmend an Bedeutung. Die Möglichkeit, mithilfe von Atomic-Force-Mikroskopen einzelne Atome und Moleküle mechanisch zu manipulieren, steht in der Medizin noch ganz am Anfang [3].

Cantilever-Sensoren

Ein weiteres mit der AFM-Technologie verwandtes Nachweisverfahren sind die Cantilever-Sensoren. Das Herzstück dieser Sensoren besteht aus mikromaschinell gefertigten Cantilevern (Hebel) mit einer Länge von zehn bis einigen hundert Mikrometern und einer Dicke von etwa einem Mikrometer, auf denen die Fängermoleküle immobilisiert werden. Kommt es nach Inkubation des Chips mit der Probe zu einem Bindungsereignis, so führt dies zu einer Änderung der Oberflächenspannung. Da sich die Oberflächenspannung nur auf einer Seite des Cantilevers ändert, verbiegt sich der Cantilever um etwa 10 nm. Diese Auslenkung kann mit einem Laser oder einem Piezosensor detektiert werden (Bild 2). Cantilever-Sensoren eignen sich sowohl für die DNA- als auch für die Proteinanalytik. Mit dem Sensor kann eine Nachweisempfindlichkeit erreicht werden, die etwa einen Faktor 20 unter dem relevanten klinischen Schwellenwert für die entsprechenden Antigene liegt. Die große Auswahl von möglichen Beschichtungen, z.B. einfache Polymere mit unterschiedlicher Chemie, aber auch Antikörper und Nukleinsäurestränge, macht dieses Sensorprinzip extrem vielseitig. Die Kleinheit des mittels Silikon-Chiptechnologie hergestellten Sensors ermöglicht die parallele Messung multipler Parameter [4].

Elektrochemische Detektion

Um Bindungsereignisse elektrochemisch mit Hilfe von Redoxreaktionen nachzuweisen, werden Biochips aus einem Siliziumsubstrat gefertigt und mit Dünnfilm-Goldelektroden versehen, deren Abstand nur 200-800 nm beträgt. Die Fängermoleküle werden direkt auf diese so genannten Interdigitalelektroden immobilisiert. Für den Nachweis von redoxaktiven Molekülen wird an die Elektroden ein Potenzial angelegt, dessen Polung sich periodisch ändert, so dass redoxaktive Moleküle an den Elektrodenoberflächen abwechselnd oxidiert und reduziert werden. Aufgrund des geringen Abstands zwischen den Elektroden wird das gleiche Molekül mehrfach hintereinander oxidiert und reduziert, wodurch sich eine Art innere Verstärkung und eine Erhöhung der Empfindlichkeit ergibt. Dieser Effekt wird als Redox-Recycling bezeichnet.

Die zu detektierenden Moleküle, z.B. DNA, werden mehrfach mit einem Enzymmarker markiert. Nach der Hybridisierung wird ein Enzymsubstrat zugesetzt, aus dem durch die Enzymreaktion das redoxaktive Molekül (z.B. p-Aminophenol) freigesetzt und infolge der Mehrfachmarkierung erheblich verstärkt gemessen wird (Bild 3). Die Nachweisempfindlichkeit lässt sich damit auf kleiner als 1 nmol/l steigern. Durch die Weiterentwicklung der Signalamplifikation soll erreicht werden, dass zukünftig auf eine Anreicherung der Zielmoleküle mittels PCR verzichtet werden kann.

Feldeffekt-Transistoren

Eine erst seit wenigen Jahren in Entwicklung befindliche Methode DNA, direkt über ein elektronisches Signal nachzuweisen, beruht auf der Verwendung von Feldeffekt-Transistoren. Bei diesen Sensoren wird die Fänger-DNA direkt auf der Gate-Elektrode eines FET-Transistors immobilisiert (Bild 4). Der FET-Transistor reagiert empfindlich auf Ladungsänderungen an der Oberfläche der Elektroden. Da das Phosphatrückgrat der DNA negativ geladen ist, lässt sich die Hybridisierung zweier DNA-Stränge anhand der sich ändernden Ladung direkt über ein elektrisches Signal messen. Die Methode ermöglicht einen markierungsfreien Nachweis von Bindungsereignissen und ist empfindlich genug, um einzelne Basenfehlpaarungen zu detektieren. Die FET-Technologie bietet prinzipiell die Möglichkeit, hochdichte Chips mit mehreren tausend Sensoren zu entwickeln. Werden elektrische Felder eingesetzt, um die Hybridisierungsprozesse zu beschleunigen, so kann die Empfindlichkeit der Methode theoretisch so weit gesteigert werden, dass DNA-Proben ohne vorherige Amplifikation (PCR) nachgewiesen werden können [5]. Eine drastische Erhöhung der Selektivität des Feldeffekt-Sensors kann nun dadurch erfolgen, dass man die Oberfläche der Transistoren (d. h. den Gateisolator) mit einer biologisch aktiven Schicht (z.B. ein Enzym) irreversibel belegt. Man spricht dann von einer Immobilisierung des Enzyms. Penicillinase kann z.B. in einem Membran-Gel immobilisiert werden. Die enzymatisch katalysierte Reaktion mit Penicillin verändert den pH-Wert an der Oberfläche und führt somit zu einem indirekten Signal für die Penicillin-Konzentration. Der Zielmarkt für FET-Sensoren reicht von DNA-Expressionsstudien bis zu Point-of-Care Anwendungen. Weltweit arbeiten derzeit drei Arbeitsgruppen an der Entwicklung dieser Technologie [6].

Magnetische Methoden

Zur Detektion von Bindungsereignissen lassen sich auch Magnetowiderstandseffekte, wie der Riesenmagnetowiderstand (GMR: giant magnetoresistive sensor) oder die Riesenmagnetoimpedanz (GMI) nutzen. Die Anwendung eines GMR-Sensors für den Nachweis von Bindungsereignissen im Biochipformat wird beschrieben. Bei der Methode besteht das Detektionssystem aus einem Chip mit GMR-Sensorelementen, die einen Durchmesser von 70 µm aufweisen. Die Sensoren lassen sich separat mit Fängermolekülen beladen und auch separat auslesen. Um Probenmoleküle nachweisen zu können, werden sie mit nanoskaligen paramagnetischen Teilchen markiert. Nach der Affinitätsbindung werden die Marker durch ein externes Magnetfeld polarisiert; die entstehenden Streufelder können dann von einem GMR-Sensor nachgewiesen werden. Die Methode zeichnet sich durch ihre Nachweisempfindlichkeit aus, die verglichen mit fluoreszenzbasierten Detektoren etwa zwei Größenordnungen höher ist [7].

Akustischer Nachweis

Ein Wissenschaftlerteam in Cambridge, UK, arbeitet an einem akustischen Sensor, mit dem neben DNA und Proteinen auch partikelförmige Krankheitserreger, wie Bakterien und Viren, nachgewiesen werden können. Im Resonance Acoustic Profiling wird das Prinzip genutzt, dass die Resonanzfrequenz eines Quarzkristalls eine Funktion der auf seiner Oberfläche adsorbierten Masse ist (Bild 5). Zum Nachweis von Biomolekülen wird der Quarzkristallresonator, der in einer Durchflusszelle integriert ist, mit Fängermolekülen beschichtet und in Resonanz versetzt. In Gegenwart von komplementären Probenmolekülen erfolgt ein Bindungsereignis, das eine Änderung der Resonanzfrequenz des Quarzkristalls zur Folge hat, die sich quantitativ auswerten lässt. Im Vergleich zu konventionellen Methoden, wie z.B. DNA-basierte Tests, hat sie den Vorteil, dass keine PCR-Amplifikation notwendig ist. Die Methode ermöglicht es, Biomoleküle markerfrei nachzuweisen und die Bindungskinetik zu bestimmen [8].

Fazit

Ein Labor im Chip-Format - die von dieser Vorstellung ausgehende Faszination motiviert weltweit Forscher auf den Gebieten der Mikrosystemtechnik, Mikrofluidik, Biotechnologie und Instrumentierung. Anbieter versprechen sich von diesen Systemen Bedienerfreundlichkeit, einfache Handhabung, zuverlässige, hochpräzise Testergebnisse, ein gleichzeitiges Auslesen einer Vielzahl von Parametern sowie eine permanente Verfügbarkeit. Trotz intensivster Anstrengungen gelang es bislang allerdings noch nicht, diese Vision auf allen Gebieten der alltäglichen Laborpraxis umzusetzen. Trotzdem sind bereits Lösungen am Markt, die das Potenzial derartiger Systeme erahnen lassen. Dazu gehören insbesondere Teststreifen für analytische Schnelltests (z.B. Schwangerschaftstest), die unter den Plattformbezeichnungen "lateral flow assays" und "capillary driven test stripes" eingeordnet werden. Neben den erwähnten Teststreifen gibt es eine Vielzahl weiterer mikrofluidischer Plattformtechnologien, auf deren Grundlage die Realisierung von Lab-on-a-Chip-Systemen erfolgen kann [1]. Jede dieser Plattformen definiert einen Satz von Basisfunktionen für z.B. Fluidtransport, Probenapplikation, Durchmischung von Reagenzien, Filtration und Detektion sowie die für diese Operationen erforderlichen Funktionseinheiten. Diese können anhand eines vorgegebenen Prozessprotokolls in ein Chipsystem integriert werden. Im Ergebnis entsteht ein anwendungsspezifisches Lab-on-a-Chip-Bauelement, welches für die vorgesehene Fragestellung eingesetzt werden kann.

Marktstudien zur Biochiptechnologie sagen für Labs-on-a-Chip und Proteinchips in den nächsten zehn Jahren die größten Wachstumsraten voraus. Auch bei diagnostischen Anwendungen, wie sie z.B. im Point-of-Care-Bereich angedacht sind, werden Systeme mit einer kleinen Sondenzahl benötigt, um bestimmte Krankheitsbilder spezifisch nachzuweisen oder die Verträglichkeit eines Patienten auf bestimmte Medikamente zu überprüfen (personalisierte Medizin). Hier wird von vielen Wissenschaftlern ein großer Zukunftsmarkt für Biochips gesehen, der im Vergleich zu den heutigen Anwendungen in der biomedizinischen Forschung ein Massenmarkt ist. Marktstudien zeigen jedoch, dass hier vergleichbare Umsätze, wie sie mit hochdichten Chipsystemen für die biomedizinische Forschung erreicht werden, innerhalb der nächsten Jahre noch nicht zu erwarten sind. Insbesondere die hohen Anforderungen hinsichtlich der Verlässlichkeit der Systeme und die regulatorischen Hürden, die genommen werden müssen, damit solche Systeme in der medizinischen Diagnostik angewendet werden können, lassen eine schnelle Marktdurchdringung noch nicht erwarten [9].

Literatur

[1] Chovan, T et al., Microfabricated devices in biotechnology and biochemical processing, Trends in Biotechnology, 20, 116-121, 2002.

[2] Nanobiotechnologie II: Anwendungen in der Medizin & Pharmazie, Bundesministerium für Bildung und Forschung.

[3] Hunziker P., Nanomedizin, Anwendungsmöglichkeiten der Nanowissenschaften in Diagnostik und Therapie, BioFokus Nr. 78, 2008.

[4] Frometa, NR., Cantilever biosensor, Biotechnologie Aplication 23; 320-323, 2006.

[5] Fritz, J. et al., Electronic detection of DNA by its intrinsic molecular charge, PNAS, 99, 14142-14146, 2002.

[6] Star A. et al., Label-free detection of DNA hybridization using carbon nanotube network field-effect transistors, PNAS, vol. 103, no. 4, 921¿926, 2006.

[7] Xu, L. et al., Giant Magnetoresistive Biochip for DNA Detection and HPVGenotyping, Biosens Bioelectron. 15; 24(1): 99-103, 2008.

[8] Godber et al., Profiling of molecular interactions in real time using acoustic detection, Biosens Bioelectron. 15; 22(9-10): 2382¿2386, 2007.

[9] Roszek, B. et al., Nanotechnology in medical applications: state-of-the-art in materials and devices. RIVM report 265001001/2005.

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