Modern statt klassisch

Entwicklung von LAMP-Assays zur Detektion von Schimmelpilzen in Lebensmitteln

Schimmelpilzinfektionen in Lebensmitteln führen zu erheblichen gesundheitlichen und wirtschaftlichen Schäden. Daher sind schnelle und sensitive Nachweismethoden, die auch vor Ort einsetzbar sind, essentiell. LAMP-Assays bieten hierfür exzellente Alternativen zu herkömmlichen Methoden der mikrobiologischen Analyse.

© Patrik Daxenbichler/shutterstock.com

Der Befall von Lebensmitteln mit Schimmelpilzen und ihren toxischen Metaboliten ist eine der Hauptursachen für Qualitätsverluste der Produkte und gesundheitliche Gefahren für Konsumenten [1 – 3]. Eine Kontamination von Lebensmittelrohstoffen und verarbeiteten Produkten mit Schimmelpilzen führt insbesondere in Entwicklungsländern zu einem direkten Verlust an Produktivität und Qualität von 5 – 10 % [4]. Neben wirtschaftlichen Aspekten beeinträchtigt die Produktion von toxischen Sekundärmetaboliten – Mykotoxinen – die Lebensmittelsicherheit [5]. Deren Einnahme kann zu akuter Toxizität sowie zu Krebs, chronischem Organversagen oder immunsuppressiver Aktivität führen [6], so dass weltweit Grenzwerte für die Präsenz in Lebensmitteln eingeführt wurden [7]. Aufgrund der gesundheitlichen Relevanz ist eine einwandfreie mikrobiologische Qualität vertriebener Produkte gemäß Lebensmittelstandards wie ISO 22000 oder IFS obligatorisch.

Um den Befall von Lebensmitteln mit Schimmelpilzen und die Produktion von Mykotoxinen zu verhindern, sind schnelle und sensitive Detektionsmethoden notwendig, die auch im Rahmen einer HACCP Analyse durchgeführt werden können. Mittels einer korrekten Identifizierung können mögliche Kontaminationsquellen gefunden, die Gefahr der Mykotoxinproduktion beurteilt und spezielle Behandlungen für die Kontrolle des Pilzwachstums angewandt werden.

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Detektionsmethoden für Schimmelpilze

Die Identifizierung von Schimmelpilzen wird oft durch phänotypische Methoden, welche Makroskopie und Mikroskopie beinhalten, durchgeführt. Diese Art der Identifizierung dauert lang und kann nur durch sehr erfahrenes Personal ausgeübt werden. Aufgrund der Abhängigkeit des Pilzwachstums und der Sporulation von geeigneten Inkubationsbedingungen und Medien sind Fehlidentifizierungen bei dieser Methode häufig [8, 9].

Eine weitere Möglichkeit der Pilzidentifizierung ist die molekulare DNA-Analyse, die heute aufgrund zuverlässiger Ergebnisse den „Goldstandard“ darstellt [10]. Die Vorbereitung der Proben für die Analyse inklusive DNA-Isolierung ist jedoch zeit- und kostenintensiv. Des Weiteren wird für die Trennung und Visualisierung des PCR-Produkts eine Agarosegelelektrophorese benötigt, was ein Problem für Vor-Ort Anwendungen in der Industrie darstellt.

Loop-mediated isothermal amplification (LAMP)

Eine alternative Methode der Nukleinsäureamplifikation erlaubt die Entwicklung schneller, sensitiver und einfach vor Ort durchführbarer Detektionsassays: die sogenannte Schleifen-vermittelte isothermale Amplifikation (Loop-mediated isothermal amplification, LAMP).

LAMP ist eine Technologie der direkten Amplifikation von spezifischen DNA-Sequenzen mit hoher Spezifität, Sensitivität und Schnelligkeit unter isothermen Bedingungen. Durch die einfache Handhabung und Durchführung sowie eine Evaluation der Ergebnisse direkt im Reaktionsgefäß ist diese Methode besonders für Vor-Ort-Anwendungen in der Industrie geeignet. Zudem wird keine zeitaufwändige DNA-Isolierung oder Gelelektrophorese benötigt, was im Gegensatz zu PCR-basierten Assays steht.

Bild 1: Schema der Probenvorbereitung und LAMP-Reaktion. © Frisch

LAMP wurde im Jahr 2000 von Notomi [11] entwickelt und nutzt eine thermophile DNA-Polymerase mit Strangverdrängungsaktivität. Das Primerset besteht aus vier Primern (FIP, BIP, F3, B3), die spezifisch für sechs Sequenzen auf der Ziel-DNA sind. Zusätzlich können zwei weitere Primer (LF, LB), die die LAMP-Reaktion beschleunigen, verwendet werden. Die Reaktion selbst wird bei einer konstanten Temperatur, z. B. in einem Wasserbad oder in einem einfachen Heizblock, durchgeführt (s. auch Bild 1).

Bild 2: Schema der LAMP-Reaktion. © Springer Nature (Quelle: Niessen, L. (2015), Current state and future perspectives of loop-mediated isothermal amplification (LAMP)-based diagnosis of filamentous fungi and yeasts; Applied Microbiology and Biotechnology 99, 553–574)

Das Prinzip von LAMP beruht auf einem initialen Schritt, in dem das primäre LAMP-Produkt produziert wird, und einem Amplifikationsschritt  – zusammen mit einem Verlängerungsschritt [12]. Die Primer FIP und dann F3 binden an ihre jeweilige Zielsequenz, um die DNA-Synthese zu starten und den resultierenden dritten Strang zu verdrängen. Die Bst-Polymerase synthetisiert unter Strangverdrängung und entlässt einen komplementären Strang, welcher aufgrund seiner Struktur eine Schleife bildet. Auf diesem Strang binden BIP und dann B3 für den Start der DNA-Synthese und Strangverdrängung, was zu der Produktion von hantelförmigen Doppelschleifen-DNA-Strukturen führt. Diese DNA-Struktur dient als Startmaterial für den DNA-Amplifikationsschritt. FIP und BIP binden an die Schleife in der Stammschleifen-DNA und fördern die strangverdrängende DNA-Synthese. Daraus resultieren verlängerte konkatemere DNA-Strukturen [11, 13], (Bild 2).

Bild 3: LAMP-Assay mit zehnfacher Verdünnungsreihe genomischer DNA von Penicillium expansum von 250 ng/Reaktion (1) bis 25 fg/Reaktion (8) [18]. Pink = positive Reaktion, orange = negative Reaktion. © Elsevier

Eine erfolgreiche Anwendung von LAMP beruht auf der ausgewählten Methode der Visualisierung der Reaktion. Zu Beginn wurde hauptsächlich die Agarosegelelektrophorese hierfür verwendet [11], welche jedoch aufgrund des Zeitaufwands und der Gefahr von Kreuzkontaminationen relativ schnell durch „in-tube“ Detektionsmethoden ersetzt wurde. Eine Methode macht sich die Freisetzung von Protonen während der DNA-Synthese zu Nutzen [14]. Mit der Verwendung von niedrig konzentrierten Puffern wird der pH-Wert während der Reaktion gesenkt, was durch den Farbumschlag eines Indikators sichtbar gemacht werden kann. Hierfür werden pH-sensitive Farbstoffe verwendet, wie z. B. Neutralrot, welches in positiven LAMP-Reaktionen zu einem Farbumschlag von orange zu pink führt (Bild 3).

Aufgrund der einfachen Handhabung bei gleichzeitig sehr hoher Sensitivität und Spezifität werden LAMP-Assays in einem breiten Anwendungsbereich verwendet. Neben der Detektion von pilzlichen Erregern werden auch bakterielle Pathogene [15] erkannt, Infektionskrankheiten in Entwicklungsländern überwacht oder Assays in der klinischen Diagnose [12, 16] verwendet. Das Review von Niessen [17] stellt eine Übersicht über LAMP-Assays zur Detektion von Mykotoxin- produzierenden Schimmelpilzen dar.

Detektion von Patulin-produzierenden Penicillium Spezies 

Ein relativ neuer Assay, der an unserem Lehrstuhl entwickelt wurde, detektiert Patulin-produzierende Penicillium-Spezies [18]. Patulin ist ein Mykotoxin, das für die Lebensmittelsicherheit und auch für Konsumenten eine mögliche Gefahr darstellt. Es führt zu akuten und chronischen Toxizitäten, so dass weltweit Grenzwerte für den Patulingehalt in Lebensmitteln festgelegt wurden [19]. Hauptsächlich findet man Patulin in Äpfeln und Trauben sowie in den daraus hergestellten Produkten, die mit dem Pilz Penicillium expansum befallen sind [20–23]. Hierbei führt vor allem die Verarbeitung von befallenen Früchten zur Kontamination des Produktes mit Patulin [24].

Patulin wird neben P. expansum auch von anderen Pilzen der Gattungen Penicillium, Aspergillus, Byssochlamys und Paecilomyces gebildet. Hierbei stellen P. expansum und weitere Penicillium-Arten die Hauptquellen für Patulin in Lebensmitteln dar [25]. Der entwickelte LAMP-Assay liefert eine gruppenspezifische Detektion von Patulin-produzierenden Penicillium- sowie Byssochlamys- und Paecilomyces-Arten mit einem Detektionslimit von 2,5 pg genomischer DNA innerhalb von 60 min. Die hohe Spezifität wurde durch das Testen von DNA von 174 Pilzarten erfolgreich gezeigt. Besonders interessant war, dass neben isolierter DNA auch Pilzsporen direkt, also ohne vorherige aufwändige DNA-Isolierung, als Probe eingesetzt werden konnten. Die Anwendbarkeit des Assays wurde mit künstlich infizierten Trauben und Äpfeln sowie Traubensaft, Apfelsaft und Apfelmus getestet. Hierbei war ein Nachweis der Pilze schon vor dem Auftreten von visuellen Symptomen des Befalls möglich. Eine einfache Probenvorbereitung [26], welche auch in der Industrie durchgeführt werden kann, war ausreichend, um eindeutige Ergebnisse zu erzielen.

Durch seine einfache Anwendung und das schnelle Detektionsergebnis bietet sich der Assay für Diagnoseapplikationen in der Qualitätskontrolle in der Lebensmittel- und Getränkeindustrie an. Gebrauchsfertige LAMP-Assays können durch Gefriertrocknung die Anwendbarkeit noch weiter verbessern. Einen limitierenden Faktor stellt jedoch dar, dass LAMP-Assays nur die Anwesenheit von DNA detektieren, nicht aber die Viabilität des Organismus oder die Produktion von Patulin in einer Probe.

Detektion des Gushing auslösenden Pilzes P. oxalicum

Des Weiteren wurde ein LAMP-Assay zur Detektion des Sekt-Gushing-auslösenden Pilzes Penicillium oxalicum entwickelt* [26]. Gushing bezeichnet das spontane Überschäumen karbonisierter Getränke nach dem sachgemäßen Öffnen nicht-geschüttelter Flaschen. Dieses Phänomen kann in allen karbonisierten Getränken, wie auch in Sekt und Schaumwein, auftreten. Hier wurde gezeigt, dass primäres Gushing durch Proteine des Pilzes P. oxalicum ausgelöst werden kann [27]. Dieser Pilz befällt Weintrauben, die auch für die Sektbereitung verwendet werden. Da Gushing zu großen wirtschaftlichen Schäden sowie Ansehensverlusten bei den Produzenten führt, sind Verfahren zur Reduktion des Phänomens wichtig.

Vogt et al. [26] entwickelten einen LAMP-Assay für den Nachweis von P. oxalicum auf Basis des kodierenden Genes eines Gushing-auslösenden Proteins. Der Nachweis des Pilzes gelang auf natürlich und künstlich infizierten Trauben und wies eine hohe Spezifität und Sensitivität auf. Dieser Assay kann von der Wein- und Schaumweinindustrie für frühzeitige Testungen der Trauben verwendet werden, so dass je nach Ergebnis angemessene Entscheidungen über die weitere Verarbeitung einer Partie gefällt werden können. Jedoch muss auch dieser Assay hinsichtlich der Anwendbarkeit auf dem Weinberg und im verarbeitenden Betrieb noch optimiert werden.

Fazit

LAMP-Assays ermöglichen die spezifische und sensitive Detektion von Schimmelpilzen in Lebensmitteln und in den eingesetzten Rohstoffen mit minimalem labortechnischem Aufwand. Der Nachweis gelingt innerhalb von 45 – 60 min und kann direkt im Anschluss visuell und ohne Messgerät abgelesen werden. Im Gegensatz zu herkömmlichen Methoden wie mikroskopischer Analyse oder PCR eignet sich LAMP besonders wegen der einfachen Handhabung sowie dem geringen finanziellen und labortechnischen Aufwand für Vor-Ort-Anwendungen in der Industrie.

AUTOREN

Lisa M. Frisch
Magdalena A. Hackhofer
Apl. Prof. Dr. Ludwig Niessen
Technische Universität München
Lehrstuhl für Technische Mikrobiologie, Freising

* Das o. g. IGF-Vorhaben der Forschungsvereinigung Forschungskreis der Ernährungsindustrie e. V. (FEI), Godesberger Allee 125, 53175 Bonn, wurde über die AiF im Rahmen des Programms zur Förderung der Industriellen Gemeinschaftsforschung (IGF) vom Bundesministerium für Wirtschaft und Energie aufgrund eines Beschlusses des Deutschen Bundestages gefördert.

Literatur

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[4] Pitt, J. I., Hocking, A. D. (2009). Fungi and Food Spoilage, 3. Aufl. Springer-Verlag US, Boston, MA.

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[6] Blackburn, C. d. W. (Hrsg.) (2004). Foodborne pathogens. Hazards, risk analysis, and control. CRC Press, Boca Raton.

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[24] Joshi, V. K., Lakhanpal, P., Kumar, V. (2013). Occurrence of Patulin its Dietary Intake through Consumption of Apple and Apple Products and Methods of its Removal. International Journal of Food and Fermentation Technology 3/1, 15.

[25] Morales, H., Sanchis, V., Coromines, J., Ramos, A. J., Marín, S. (2008). Inoculum size and intraspecific interactions affects Penicillium expansum growth and patulin accumulation in apples. Food Microbiology 25/2, 378–385.

[26] Vogt, E. I., Kupfer, V. M., Bechtner, J. D., Frisch, L. M., Vogel, R. F., Niessen, L. (2017). Detection of Penicillium oxalicum in Grapes with a Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assay. Journal of Microbiology, Biotechnology and Food Sciences 7/3, 265–270.

[27] Vogt, E. I., Kupfer, V. M., Vogel, R. F., Niessen, L. (2017). Evidence of gushing induction by Penicillium oxalicum proteins. Journal of Applied Microbiology 122/3, 708–718.

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