Bild 1: Schema der Probenvorbereitung und LAMP-Reaktion. © Frisch

LAMP wurde im Jahr 2000 von Notomi [11] entwickelt und nutzt eine thermophile DNA-Polymerase mit Strangverdrängungsaktivität. Das Primerset besteht aus vier Primern (FIP, BIP, F3, B3), die spezifisch für sechs Sequenzen auf der Ziel-DNA sind. Zusätzlich können zwei weitere Primer (LF, LB), die die LAMP-Reaktion beschleunigen, verwendet werden. Die Reaktion selbst wird bei einer konstanten Temperatur, z. B. in einem Wasserbad oder in einem einfachen Heizblock, durchgeführt (s. auch Bild 1).

Bild 2: Schema der LAMP-Reaktion. © Springer Nature (Quelle: Niessen, L. (2015), Current state and future perspectives of loop-mediated isothermal amplification (LAMP)-based diagnosis of filamentous fungi and yeasts; Applied Microbiology and Biotechnology 99, 553–574)

Das Prinzip von LAMP beruht auf einem initialen Schritt, in dem das primäre LAMP-Produkt produziert wird, und einem Amplifikationsschritt  – zusammen mit einem Verlängerungsschritt [12]. Die Primer FIP und dann F3 binden an ihre jeweilige Zielsequenz, um die DNA-Synthese zu starten und den resultierenden dritten Strang zu verdrängen. Die Bst-Polymerase synthetisiert unter Strangverdrängung und entlässt einen komplementären Strang, welcher aufgrund seiner Struktur eine Schleife bildet. Auf diesem Strang binden BIP und dann B3 für den Start der DNA-Synthese und Strangverdrängung, was zu der Produktion von hantelförmigen Doppelschleifen-DNA-Strukturen führt. Diese DNA-Struktur dient als Startmaterial für den DNA-Amplifikationsschritt. FIP und BIP binden an die Schleife in der Stammschleifen-DNA und fördern die strangverdrängende DNA-Synthese. Daraus resultieren verlängerte konkatemere DNA-Strukturen [11, 13], (Bild 2).

Bild 3: LAMP-Assay mit zehnfacher Verdünnungsreihe genomischer DNA von Penicillium expansum von 250 ng/Reaktion (1) bis 25 fg/Reaktion (8) [18]. Pink = positive Reaktion, orange = negative Reaktion. © Elsevier

Eine erfolgreiche Anwendung von LAMP beruht auf der ausgewählten Methode der Visualisierung der Reaktion. Zu Beginn wurde hauptsächlich die Agarosegelelektrophorese hierfür verwendet [11], welche jedoch aufgrund des Zeitaufwands und der Gefahr von Kreuzkontaminationen relativ schnell durch „in-tube“ Detektionsmethoden ersetzt wurde. Eine Methode macht sich die Freisetzung von Protonen während der DNA-Synthese zu Nutzen [14]. Mit der Verwendung von niedrig konzentrierten Puffern wird der pH-Wert während der Reaktion gesenkt, was durch den Farbumschlag eines Indikators sichtbar gemacht werden kann. Hierfür werden pH-sensitive Farbstoffe verwendet, wie z. B. Neutralrot, welches in positiven LAMP-Reaktionen zu einem Farbumschlag von orange zu pink führt (Bild 3).

Aufgrund der einfachen Handhabung bei gleichzeitig sehr hoher Sensitivität und Spezifität werden LAMP-Assays in einem breiten Anwendungsbereich verwendet. Neben der Detektion von pilzlichen Erregern werden auch bakterielle Pathogene [15] erkannt, Infektionskrankheiten in Entwicklungsländern überwacht oder Assays in der klinischen Diagnose [12, 16] verwendet. Das Review von Niessen [17] stellt eine Übersicht über LAMP-Assays zur Detektion von Mykotoxin- produzierenden Schimmelpilzen dar.

Detektion von Patulin-produzierenden Penicillium Spezies 

Ein relativ neuer Assay, der an unserem Lehrstuhl entwickelt wurde, detektiert Patulin-produzierende Penicillium-Spezies [18]. Patulin ist ein Mykotoxin, das für die Lebensmittelsicherheit und auch für Konsumenten eine mögliche Gefahr darstellt. Es führt zu akuten und chronischen Toxizitäten, so dass weltweit Grenzwerte für den Patulingehalt in Lebensmitteln festgelegt wurden [19]. Hauptsächlich findet man Patulin in Äpfeln und Trauben sowie in den daraus hergestellten Produkten, die mit dem Pilz Penicillium expansum befallen sind [20–23]. Hierbei führt vor allem die Verarbeitung von befallenen Früchten zur Kontamination des Produktes mit Patulin [24].

Patulin wird neben P. expansum auch von anderen Pilzen der Gattungen Penicillium, Aspergillus, Byssochlamys und Paecilomyces gebildet. Hierbei stellen P. expansum und weitere Penicillium-Arten die Hauptquellen für Patulin in Lebensmitteln dar [25]. Der entwickelte LAMP-Assay liefert eine gruppenspezifische Detektion von Patulin-produzierenden Penicillium- sowie Byssochlamys- und Paecilomyces-Arten mit einem Detektionslimit von 2,5 pg genomischer DNA innerhalb von 60 min. Die hohe Spezifität wurde durch das Testen von DNA von 174 Pilzarten erfolgreich gezeigt. Besonders interessant war, dass neben isolierter DNA auch Pilzsporen direkt, also ohne vorherige aufwändige DNA-Isolierung, als Probe eingesetzt werden konnten. Die Anwendbarkeit des Assays wurde mit künstlich infizierten Trauben und Äpfeln sowie Traubensaft, Apfelsaft und Apfelmus getestet. Hierbei war ein Nachweis der Pilze schon vor dem Auftreten von visuellen Symptomen des Befalls möglich. Eine einfache Probenvorbereitung [26], welche auch in der Industrie durchgeführt werden kann, war ausreichend, um eindeutige Ergebnisse zu erzielen.

Durch seine einfache Anwendung und das schnelle Detektionsergebnis bietet sich der Assay für Diagnoseapplikationen in der Qualitätskontrolle in der Lebensmittel- und Getränkeindustrie an. Gebrauchsfertige LAMP-Assays können durch Gefriertrocknung die Anwendbarkeit noch weiter verbessern. Einen limitierenden Faktor stellt jedoch dar, dass LAMP-Assays nur die Anwesenheit von DNA detektieren, nicht aber die Viabilität des Organismus oder die Produktion von Patulin in einer Probe.

Detektion des Gushing auslösenden Pilzes P. oxalicum

Des Weiteren wurde ein LAMP-Assay zur Detektion des Sekt-Gushing-auslösenden Pilzes Penicillium oxalicum entwickelt* [26]. Gushing bezeichnet das spontane Überschäumen karbonisierter Getränke nach dem sachgemäßen Öffnen nicht-geschüttelter Flaschen. Dieses Phänomen kann in allen karbonisierten Getränken, wie auch in Sekt und Schaumwein, auftreten. Hier wurde gezeigt, dass primäres Gushing durch Proteine des Pilzes P. oxalicum ausgelöst werden kann [27]. Dieser Pilz befällt Weintrauben, die auch für die Sektbereitung verwendet werden. Da Gushing zu großen wirtschaftlichen Schäden sowie Ansehensverlusten bei den Produzenten führt, sind Verfahren zur Reduktion des Phänomens wichtig.

Vogt et al. [26] entwickelten einen LAMP-Assay für den Nachweis von P. oxalicum auf Basis des kodierenden Genes eines Gushing-auslösenden Proteins. Der Nachweis des Pilzes gelang auf natürlich und künstlich infizierten Trauben und wies eine hohe Spezifität und Sensitivität auf. Dieser Assay kann von der Wein- und Schaumweinindustrie für frühzeitige Testungen der Trauben verwendet werden, so dass je nach Ergebnis angemessene Entscheidungen über die weitere Verarbeitung einer Partie gefällt werden können. Jedoch muss auch dieser Assay hinsichtlich der Anwendbarkeit auf dem Weinberg und im verarbeitenden Betrieb noch optimiert werden.

Fazit

LAMP-Assays ermöglichen die spezifische und sensitive Detektion von Schimmelpilzen in Lebensmitteln und in den eingesetzten Rohstoffen mit minimalem labortechnischem Aufwand. Der Nachweis gelingt innerhalb von 45 – 60 min und kann direkt im Anschluss visuell und ohne Messgerät abgelesen werden. Im Gegensatz zu herkömmlichen Methoden wie mikroskopischer Analyse oder PCR eignet sich LAMP besonders wegen der einfachen Handhabung sowie dem geringen finanziellen und labortechnischen Aufwand für Vor-Ort-Anwendungen in der Industrie.

AUTOREN

Lisa M. Frisch
Magdalena A. Hackhofer
Apl. Prof. Dr. Ludwig Niessen
Technische Universität München
Lehrstuhl für Technische Mikrobiologie, Freising

* Das o. g. IGF-Vorhaben der Forschungsvereinigung Forschungskreis der Ernährungsindustrie e. V. (FEI), Godesberger Allee 125, 53175 Bonn, wurde über die AiF im Rahmen des Programms zur Förderung der Industriellen Gemeinschaftsforschung (IGF) vom Bundesministerium für Wirtschaft und Energie aufgrund eines Beschlusses des Deutschen Bundestages gefördert.

Literatur

[1] Filtenborg, O., Frisvad, J. C., Thrane, U. (1996). Moulds in food spoilage. International Journal of Food Microbiology 33/1, 85–102.

[2] Frisvad, J. C., Andersen, B., Samson, R. A. (2007). Association of moulds to food. J. Dijksterhuis und R.A. Samson (ed.). Food Mycology: A Multifaceted Approach to Fungi and Food. CRC Press. Boca Raton, Florida.

[3] Moss, M. O. (1996). Mycotoxins. Mycological Research. 100, 513–523.

[4] Pitt, J. I., Hocking, A. D. (2009). Fungi and Food Spoilage, 3. Aufl. Springer-Verlag US, Boston, MA.

[5] Tham, W., Danielsson-Tham, M.-L. (Hrsg.) (2014). Food associated pathogens. Taylor & Francis, Boca Raton.

[6] Blackburn, C. d. W. (Hrsg.) (2004). Foodborne pathogens. Hazards, risk analysis, and control. CRC Press, Boca Raton.

[7] Boutrif, E., Canet, C. (1998). Mycotoxin prevention and control: FAO Programmes. Ref. Vét. Méd.

[8] Balajee, S. A., Sigler, L., Brandt, M. E. (2007). DNA and the classical way. Identification of medically important molds in the 21st century. Medical Mycology 45/6, 475–490.

[9] Ciardo, D. E., Schär, G., Altwegg, M., Böttger, E. C., Bosshard, P. P. (2007). Identification of moulds in the diagnostic laboratory—an algorithm implementing molecular and phenotypic methods. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease 59/1, 49–60.

[10] Summerbell, R. C., Lévesque, C. A., Seifert, K. A., Bovers, M., Fell, J. W., Diaz, M. R., Boekhout, T., Hoog, G. S. de, Stalpers, J., Crous, P. W. (2005). Microcoding. The second step in DNA barcoding. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences 360/1462, 1897–1903.
[11] Notomi, T. (2000). Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Research 28/12, 63e-63.

[12] Mori, Y., Notomi, T. (2009). Loop-mediated isothermal amplification (LAMP). A rapid, accurate, and cost-effective diagnostic method for infectious diseases. Journal of Infection and Chemotherapy: Official Journal of the Japan Society of Chemo­therapy 15/2, 62–69.

[13] Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. (2008). Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products. Nature Protocols 3/5, 877–882.

[14] Tanner, N. A., Zhang, Y., Evans, T. C. (2015). Visual detection of isothermal nucleic acid amplification using pH-sensitive dyes. BioTechniques 58/2, 59–68.

[15] Niessen, L., Luo, J., Denschlag, C., Vogel, R. F. (2013). The application of loop-mediated isothermal amplification (LAMP) in food testing for bacterial pathogens and fungal contaminants. Food Micro­biology 36/2, 191–206.

[16] Fu, S., Qu, G., Guo, S., Ma, L., Zhang, N., Zhang, S., Gao, S., Shen, Z. (2011). Applications of loop-mediated isothermal DNA amplification. Applied Biochemistry and Biotechnology 163/7, 845–850.

[17] Niessen, L. (2018). The application of loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays for the rapid diagnosis of food-borne mycotoxigenic fungi. Current Opinion in Food Science 23, 11–22.

[18] Frisch, L. M., Niessen, L. (2019). Development and optimization of a group-specific loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay for the detection of patulin-producing Penicillium species. International Journal of Food Microbiology 298, 20–30.

[19] European Commission (2006). Commission regulation no 1881/2006 setting maximum levels for certain contaminants in food stuff, 19.12.2006. OJ L 364, 5–24.

[20] Harwig, J., Chen, Y.-K., Kennedy, B.P.C., Scott, P. M. (1973). Occurrence of Patulin and Patulin-Producing Strains of Penicillium expansum in Natural Rots of Apple in Canada. Canadian Institute of Food Science and Technology Journal 6/1, 22–25.

[21] Moss, M. O. (1998). Recent studies of mycotoxins. Journal of Applied Microbiology 84/S1, 62S-76S.

[22] Scott, P. M., Fuleki, T., Harwig, J. (1977). Patulin content of juice and wine produced from moldy grapes. Journal of Agricultural and Food Chemistry 25/2, 434–437.

[23] Scott, P. M., Miles, W. F., Toft, P., Dubé, J. G. (1972). Occurrence of Patulin in Apple Juice. Journal of Agricultural and Food Chemistry 20/2, 450–451.

[24] Joshi, V. K., Lakhanpal, P., Kumar, V. (2013). Occurrence of Patulin its Dietary Intake through Consumption of Apple and Apple Products and Methods of its Removal. International Journal of Food and Fermentation Technology 3/1, 15.

[25] Morales, H., Sanchis, V., Coromines, J., Ramos, A. J., Marín, S. (2008). Inoculum size and intraspecific interactions affects Penicillium expansum growth and patulin accumulation in apples. Food Microbiology 25/2, 378–385.

[26] Vogt, E. I., Kupfer, V. M., Bechtner, J. D., Frisch, L. M., Vogel, R. F., Niessen, L. (2017). Detection of Penicillium oxalicum in Grapes with a Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assay. Journal of Microbiology, Biotechnology and Food Sciences 7/3, 265–270.

[27] Vogt, E. I., Kupfer, V. M., Vogel, R. F., Niessen, L. (2017). Evidence of gushing induction by Penicillium oxalicum proteins. Journal of Applied Microbiology 122/3, 708–718.