Fachbeitrag

Bessere konfokale Mikroskopie durch neue Funktionen


Bild 3: Gliazellen aus dem Zentralnervensystem der Ratte, gefärbt mit DAPI (blau) und Alexa 488 (grün).
Das Laser-Scanning-Mikroskop LSM 710

Dr. Ralf Engelmann, Dr. Bernhard Goetze, Dr. Stephan Kuppig*)

  1. Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Jena, E-Mail: Mikro@zeiss.de, Web: http://www.zeiss.de/lsm
Das Unternehmen Carl Zeiss definiert mit dem Laser-Scanning-Mikroskop LSM 710 neue Maßstäbe für Empfindlichkeit und Flexibilität bei der Untersuchung fluoreszierender Proben in der Biologie. Mit höherer Empfindlichkeit bei geringerem Bildrauschen, verbesserter Flexibilität für den Einsatz neuer Fluoreszenzfarbstoffe und neuen Multiphotonen-Detektoren kann das neue LSM-System vielen biologischen Experimenten neue Impulse geben.

Carl Zeiss hat im Februar 2008 ein neues konfokales Laser-Scanning-Mikroskop vorgestellt, das LSM 710 (Bild 1). Bei der Entwicklung dieses Gerätes galt es, zwei Herausforderungen zu lösen: Die Vermeidung von jeglichem Hintergrundsignal, um die nutzbare Empfindlichkeit deutlich zu steigern, und die Schaffung unbegrenzter Freiheit bei der Farbstoff-Auswahl und deren Detektion. Unter anderem wurden hierfür zwei besondere Neuerungen entwickelt: Der TwinGate-Hauptfarbteiler mit neuer Geometrie und herausragender Laserunterdrückung, und der spektrale QUASAR-Detektor mit völlig frei einstellbaren Detektionsbändern, die nicht mehr durch die Laser-Anregungslinien begrenzt sind.

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Als Ergebnis dieser und anderer Neuerungen liefert das LSM 710 herausragende Empfindlichkeit auch bei anspruchsvollen, mehrfach markierten Präparaten (zum Beispiel lebenden Gewebeproben) und erzeugt detailgenaue, kontrastreiche Bilder. Die Bedienung ist dabei deutlich vereinfacht worden und unterstützt den Anwender sowohl mit automatischer Selbstkalibrierung als auch mit automatischer Einstellung der Aufnahmeparameter durch die Smart-Setup-Funktion.

Reduzierter Signal-Hintergrund

Eines der Hauptprobleme bei der Mikroskopie von 3-dimensionalen Proben ist die Vermeidung von Hintergrund. Dieser kann optische oder elektronischen Ursachen haben, in jedem Fall begrenzt er aber die nutzbare Empfindlichkeit der bereits extrem leistungsfähigen Fluoreszenzdetektoren. Dies führt in herkömmlichen Systemen dazu, dass sehr feine, lichtschwache oder bleichempfindliche Strukturen nicht mehr dargestellt werden können. Carl Zeiss hat zur Lösung dieses Problems neben einer neuen, extrem rauscharmen Elektronik den TwinGate-Farbteiler entwickelt, der das optische Rauschen dramatisch reduziert.

Das innovative TwinGate-Farbteiler-Konzept ermöglicht per Unterdrückung des Anregungslaserlichts brillante, kontrastreiche Bilder. Durch einen steilen Winkel, in dem das Licht nahezu orthogonal auf die Hochleistungsfilter auftritt (Bild 2), werden die Unterdrückungswerte für die störende Laseranregung ideal, und die Transmission des Fluoreszenzlichts steigt auf deutlich über 90 %.

Der TwinGate unterstützt durch seine Doppelanordnung (Bild 2, siehe I, V) in der Praxis bis zu 50 Laserlinienkombinationen von nahem UV bis IR, und bietet vom Nutzer einzeln wechselbare Filter. Damit verfügt TwinGate über ideale Voraussetzungen für die effektive Anregung der Fluoreszenz-Farbstoffe bei gleichzeitig hoher Bildqualität. Der Hintergrund im LSM 710 ist perfekt schwarz, bei gleichzeitig hell leuchtenden, feinst aufgelösten Strukturen. Die Laserleistung kann soweit reduziert werden, dass auch lebende Zellen ohne Schädigung über lange Zeit mikroskopiert werden können (Bild 3).

Mehr Flexibilität bei Detektion

Bei mehrfach markierten Präparaten stellt sich generell das Problem, die sich in der Emission häufig überlappenden Farbstoffe optimal zu detektieren. Dabei soll zum einen der jeweilige Detektionsbereich völlig frei an die Erfordernisse des Farbstoffs angepasst werden, zum anderen soll die Detektion möglichst simultan und ohne probenbelastende Mehrfachaufnahme erfolgen. Herkömmliche Filtertechnologien mit vordefinierten Bandpässen verschenken oft Signal oder schreiben die Nutzung bestimmter Farbstoffe vor.

Der neue QUASAR-Detektor des LSM 710 ist empfindlicher und flexibler als alle bisherigen Detektortechnologien. Basis ist eine filterfreie, über den gesamten Wellenlängenbereich stufenlos einstellbare spektrale Detektionseinheit, die mit verstellbaren optischen Keilen und Blenden den jeweils gewünschten Wellenlängenbereich auf den bestgeeigneten Detektor leitet (Bild 4). Dabei fungiert die Spitze des Keils als eine Detektionsgrenze, die Blende als die andere. Durch Verfahren im Spektrum kann jeder gewünschte Lang-, Band- oder Kurzpass erzeugt werden, ohne dass herkömmliche Nebenfarbteiler oder Emissions-Sperrfilter vor den Detektoren benötigt werden (Bild 4, siehe P, S, D). Damit kann die Detektion ideal an die verwendeten Farbstoffe angepasst werden. Zudem muss dabei auch keine Rücksicht mehr auf die Anregungslaserlinien genommen werden. Diese sind vom TwinGate bereits ausreichend unterdrückt.

Systeme mit QUASAR-Detektor können bis zu zehn Farbstoffe gleichzeitig aufnehmen, und stellen diese mit bis zu 34 spektralen Datenpunkten dar. Somit lassen sich Präparate mit Mehrfachfluoreszenzen (Bild 5) detailgenau auflösen, und eventuelles Übersprechen zwischen den Farbstoffen kann zuverlässig mittels linearem Unmixing entfernt werden. Somit ist die Gefahr von Artefakten und falscher Colokalisation durch falsche Filtereinstellungen ausgeschlossen. Eine eindeutige Lokalisierbarkeit auch komplexer Strukturen in dicken Proben ist das Ergebnis (Bild 5). Der QUASAR-Detektor bietet bis zu 3 nm spektrale Auflösung, wobei das Spektrum durch ein optisches Gitter mit Recycling Loop effizient aufgespaltet wird.

Multiphotonen- Technologie

Die Qualität der Bilddaten des LSM 710, die hohe Empfindlichkeit und die Freiheit von störendem Hintergrund erlaubt auch quantitative Analysen. Innovative Verfahren wie die integrierte Raster-Image-Correlation-Spektroskopie (RICS) erlauben, quantitative Informationen über Molekülkonzentrationen und -beweglichkeiten direkt aus den aufgenommenen konfokalen Bildern zu extrahieren.

Weitere herausragende Vorteile des LSM 710 sind das PTC-Laserkonzept, das ohne Lasermodul auskommt und eine flexible Kombination sowie schnelle Aufrüstung verschiedenster Laser vom Nah-UV- bis in den Infrarot-Bereich erlaubt. Letzterer ermöglicht in den sogenannten NLO-Systemen (NLO = Nicht-lineare Optik) ein besonders tiefes Eindringen in die Probe (mehrere 100 µm) durch die Multiphotonen-Technologie.

Das entsprechend ausgerüstete LSM 710 NLO stellt eine verbesserte Femtosekunden-Multiphotonen-Technologie zur Verfügung, die Neuro- und Entwicklungsbiologen, Immunologen und Pflanzenbiologen die z.B. durch Pulsanpassung besonders schonende Untersuchung lebender und komplexer biologischer Proben ermöglicht.

Erstmals ist die Aufzeichnung von bis zu fünf Fluoreszenzsignalen im Non-descanned-Modus gleichzeitig möglich. Außerdem sorgt eine Spezialvariante des Non-descanned-Detektors mit GaAsP-Technologie und Signalauskopplung direkt am Objektiv für eine nochmals 2-fach höhere Sensitivität.

Zusammenfassung

Das LSM 710 bietet mit der Unterdrückung des Anregungs-Laserlichts im flexiblen TwinGate-Hauptfarbteiler ideale Voraussetzungen für eine hochempfindliche und effiziente Abbildung der Probe. Das neue QUASAR-Detektionsdesign bietet absolute Freiheit in der Auswahl und simultanen Abbildung von bis zu zehn Fluoreszenzsignalen. Beides gestattet dem Anwender hohe Flexibilität und optimale Anpassung an die Erfordernisse des Untersuchungsobjektes, so dass eine schonende und detailgenaue Abbildung realisiert werden kann.

Automatisierte, dem Nutzer jederzeit zur Verfügung stehende Software-Werkzeuge zur System-Kalibrierung stellen darüber hinaus sicher, dass das LSM 710 stets im optimalen Leistungsbereich arbeitet.

Ein weiteres System-Highlight ist die „Smart Setup“-Funktion, für die automatische, farbstoffzentrierte Geräteeinstellung. Der Weg zum Bild wird damit schneller und einfacher als bisher.

Die Laser-Scanning-Mikroskope LSM 710 und LSM 710 NLO können mit aufrechten und inversen Lichtmikroskopstativen der Axio-Serie von Carl Zeiss kombiniert werden.

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