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MikroskopieReading und Imaging

vereint im neuen Cytation3¿.

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Mikroskopie: Reading und Imaging

Warum Imaging?
Das alte Sprichwort "Ein Bild sagt mehr als tausend Worte" hat auch in der Zellbiologie seine Berechtigung. Die Visualisierung von Zellen - den Grundbausteinen des Lebens - begann schon vor 400 Jahren mit der Einführung der Mikroskope durch Hooke und van Leeuwenhoek. Ihre volle Leistungsfähigkeit erreichte die Mikroskopie jedoch erst mit der Fluoreszenzmikroskopie und einer immer umfangreicheren Palette an Fluoreszenzsonden, mit denen sich die an der zellulären Signalübertragung beteiligten Moleküle sichtbar machen lassen.

Warum Mikroplatten?
Das Imaging erfolgt in der Regel an Objektträgern mit jeweils einem Objektträger pro Analyse. Mit Mikroplatten können mehrere Analysen in einem praktischen, kostengünstigen Gefäß durchgeführt werden. Reagenzienverbrauch (Analysekosten!) lassen sich so minimieren und die Analyseeffizienz steigern. Hersteller von Mikroplatten bieten unzählige Protokolle für die Kultivierung von praktisch jeder Art von Zellen an, seien es immortalisierte, primäre oder Stammzellen. Mit diesen Protokollen können unterschiedliche Applikationen schnell und einfach durchgeführt werden, so u.a. qualitative Färbung fixierter Zellen, Lebendzell-Imaging sowie quantitative Assays mit lebenden Zellen und Endpunkt-Assays.

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Warum Imaging in einem Mikroplatten-Reader?
Der Mikroplatten-Reader ist ein universell einsetzbares Laborgerät. Er kommt bei der Quantifizierung von Nukleinsäuren und Proteinen, bei ELISA- und enzymkinetischen Tests, Zytotoxizitäts-Assays und unzähligen anderen Applikationen zum Einsatz. Viele Reader bieten mehrere Detektionstechnologien, darunter die gängigsten Absorption-, Fluoreszenz- und Lumineszenzmessungen, aber auch spezielle Modi wie FRET, TR-FRET und Fluoreszenzpolarisation. Allgemein gilt der Mikroplatten-Reader im Labor als das "Arbeitstier" für quantitative Messungen. Die Ergänzung der Detektionsfunktionen um einen Imagingmodus macht das Gerät endgültig unverzichtbar.

Das aus Imaging und Mikroplattendetektion entstehende Ganze ist erheblich größer als die Summe seiner Teile. Durch Kombination der beiden Detektionsmodalitäten ergeben sich bislang unerreichte Möglichkeiten. Quantitative Messungen mit dem Mikroplatten-Reader können bei Erreichen eines bestimmten Schwellenwerts als Trigger für das Imaging der Wells eingesetzt werden. Auf diese Weise kann die Anzahl der Wells, die mit bildgebenden Verfahren dargestellt werden müssen, deutlich verringert werden. Somit verkürzt sich erstens die Gesamtanalysedauer und zum zweiten verringert sich der Speicherbedarf für Bilddaten - hinlänglich bekannte Engpässe beim High-Content-Screening. Zwei unterschiedliche Messtechniken können damit in ein und derselben Platte kombiniert und zu ihrem jeweiligen Vorteil genutzt werden. Das reduziert Zeit, die Anzahl der Arbeitsschritte und den Materialbedarf. Darüber hinaus spart dieses "all-in-one"-Gerät wertvollen Laborplatz.

Der kompakte Cytation3 verfügt über drei eigenständige optische Systeme, monochromatorbasiertes System, filterbasiertes System und Imaging-System. Letzteres kann frei kombiniert werden. Das Imagingsystem kann mit bis zu vier LED-Cubes und vier Filtercubes (jeweils für einen Farbkanal) ausgestattet werden. Es enthält außerdem zwei einfach auswechselbare Objektive, die mittels Gen5 Software ausgewählt werden. Zur schnellen Datenübertragung arbeitet der Cytation3 mit einer 16-Bit CCD-Graustufenkamera mit Sony-Chip, welche mehr als 65.500 unterschiedliche Intensitätswerte pro Pixel im Bild erfassen kann.

Der Cytation3 verfügt über zwei Imagingmodi: manuelles Imaging und automatisiertes Imaging. Beim manuellen Imaging kann der Anwender wie bei der Arbeit mit einem Standard-Fluoreszenzmikroskop in Echtzeit mit der Probe interagieren. Er hat uneingeschränkte Möglichkeiten zur Navigation in der Probe, Fokussierung, Einstellung der Kamerabelichtung, Wahl des Objektivtyps und Erfassung von Einzel- oder Mehrkanalbildern im RGB- oder Hellfeldmodus. Die manuelle Bildaufnahme eignet sich ideal für das Imaging bei geringer Probenanzahl, für die rasche Überprüfung des Zustands von Zellen oder Proben und für die Überprüfung einer Probe auf korrekte Färbung vor Durchführung eines automatisierten Laufs.

Bei der automatisierten Bildaufnahme mit dem Cytation3 kann der Anwender anhand der mitgelieferten Software Protokolle definieren, um Bilder von einer größeren Anzahl von Wells oder Proben zu erfassen. Im automatisierten Modus können Wells außerdem anhand spezifischer Kriterien gezielt für die Bildgebung ausgewählt werden. Damit wird die erfasste Datenmenge reduziert und der Aufwand für die Qualitätskontrolle der Bilder in den nachgelagerten Schritten sinkt erheblich.

In beiden Aufnahmemodi können die drei belichtungsrelevanten Variablen und die Fokusparameter manuell angepasst oder automatisch eingestellt werden. So können durch die Anpassung der LED-Intensität, der Integrationszeit und der Kameraverstärkung z.B. die Helligkeit des Livebildes und der Aufnahme individuell optimiert werden.

Mit der Zellanalyse können viele Parameter auf Zellebene, beispielsweise die Objektgröße, Intensität und Zirkularität, analysiert werden. Für alle identifizierten Objekte in dem Bild wird eine Gesamtzählung ausgegeben, die etwa bei Zytotoxizitäts- und Proliferationsstudien von Nutzen ist. Mit Hilfe von definierten Plugs können außerdem Zellmigrationsstudien durchgeführt werden.

Zahlreiche Bildformate, darunter die häufig verwendeten Formate TIF, JPEG, PNG, GIF, BMP und EMF, ermöglichen die Weiterverarbeitung der Bilder nicht nur mit der BioTek Software Gen5, sondern auch mit Imaging Softwarepaketen anderer Hersteller.

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