Wasseranalytik durch Festphasenmikroextraktion

Fest statt flüssig

Die SPME kann bei der Wasseranalytik gegenüber der LLE mit deutlichen Vorteilen punkten. Der Einsatz der Festphasenmikroextraktion (SPME) ermöglicht die lösungsmittelfreie Extraktion der Wasserphase in Biokonzentrationsstudien und liefert wertvolle Zusatzinformationen zum Anteil bioverfügbarer Konzentrationen.

SPME in der Wasseranalytik. (Bild: Leonard Böhm, Uni Mainz)

Im Rahmen von Zulassungsstudien wird entsprechend nationaler bzw. internationaler Regulierung eine umfangreiche Bewertung der Chemikalien auf Grundlage verschiedener experimenteller Studien durchgeführt. Für die Risikoabschätzung von hydrophoben Chemikalien wird ihr Bioakkumulationspotenzial, also ihre Affinität zur Anreicherung in Organismen, untersucht. Für aquatische Systeme werden üblicherweise Biokonzentrationsstudien mit Fischen gemäß der OECD-Richtlinie 305 durchgeführt [1]. Der maßgebliche Aufnahmepfad ist hier über die Kiemen der Tiere gegeben. Endpunkt der Studien ist der Biokonzentrationsfaktor (bioconcentration factor, BCF), ein Quotient der als Steady-state-BCF das Gleichgewicht der Verteilung einer Substanz zwischen Fisch und Wasser beschreibt.

Bei der Konzentrationsbestimmung wird die Extraktion der Wasserphase in der Regel lösungsmittelbasiert durchgeführt, z. B. mit der Flüssig-Flüssig-Extraktion (liquid-liquid extraction, LLE). Neben dem Verbrauch (toxischer) Lösungsmittel geht mit diesem klassischen Verfahren v. a. ein hoher manueller Arbeitsaufwand im Labor einher. Da es sich um ein weitestgehend erschöpfendes Extraktionsverfahren handelt, wird die LLE jedoch auch hinsichtlich möglicher Artefakte bei der Extraktion stark hydrophober organischer Chemikalien (hydrophobic organic chemicals, HOC) diskutiert.

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Relevanz bioverfügbarer Konzentrationen
BCF-Werte neutraler organischer Chemikalien steigen in der Regel mit steigender Hydrophobizität der Chemikalien, wobei die Hydrophobizität durch die Höhe des n-Octanol-Wasser-Verteilungskoeffizienten (KOW) abgeschätzt wird. Gelöste und partikuläre organische Substanzen im Testsystem können jedoch durch Sorptionsprozesse zu einem Rückgang der frei gelösten, bioverfügbaren Chemikalienkonzentration führen. Sofern BCF-Werte auf Basis von Gesamtgehalten statt bioverfügbarer Chemikalienkonzentrationen berechnet werden, kann es somit theoretisch zu einer Unterschätzung der Bioakkumulation kommen. Im Gegensatz zur LLE lassen sich mit der Festphasenmikroextraktion (solid-phase microextraction, SPME) (-> Textkasten), bei gleichzeitig geringerem Arbeitsaufwand, gesamte und freie Substanzkonzentrationen unterscheiden [2].

Bild 1. Schematische Darstellung der Biokonzentrationsstudien: Vergleich von Festphasenmikroextraktion (solid-phase microextraction, SPME) und Lösungsmittelextraktion (liquid–liquid extraction, LLE) zur Bestimmung von Gesamtgehalten (Ctotal) und frei gelösten/bioverfügbaren Konzentrationen (Cfree) von hydrophoben organischen Chemikalien in der Wasserphase (Cw) in Biokonzentrationsstudien mit Fischen (BCF-Test), bei Anwesenheit von organischer Substanz im Testsystem (braune Partikel) (Bild nicht maßstabsgetreu) [5]. (Bild: Leonard Böhm)

Biokonzentrationsstudien mit HOCs
In einer durch das Umweltbundesamt geförderten Studie wurde die mögliche Verwendung der SPME für die Wasseranalytik in BCF-Studien im Vergleich zur LLE geprüft. Die parallele Bestimmung von Gesamtgehalten und bioverfügbaren HOC-Konzentrationen mittels SPME wurde in Durchflussstudien mit Regenbogenforellen (Oncorhynchus mykiss) und drei HOC (log KOW 5,7 – 7,8) getestet und die potenzielle Ersetzung der LLE wurde durch die SPME überprüft (Bild 1).

Durch die SPME-Fasern wird lediglich ein Anteil der frei gelösten, bioverfügbaren Chemikalienkonzentration extrahiert. Durch die Zugabe eines internen Standards mit gleichen physikochemischen Eigenschaften (im besten Fall die mit stabilen Isotopen markierte Testsubstanz) lassen sich jedoch auch Gesamtgehalte ermitteln, da die Sorption des internen Standards an organische Substanz in den Proben in gleichem Maße erfolgt wie die sorptionsbedingte Reduktion der frei gelösten Testsubstanzkonzentration.

Die Applikation der schwer wasserlöslichen Substanzen in den BCF-Studien wurde lösungsmittelfrei mit einem „solid-phase desorption dosing system“ durchgeführt [3]. Der Einfluss relevanter organischer Substanz (Fischfutter, Ausscheidungen) im Testsystem wurde dabei auch in systematischen Sorptionsversuchen geprüft [4, 5]. Innerhalb der Testdauer von ca. zwei Monaten wurden regelmäßig Wasserproben aus dem Versuchstank entnommen, mit internen Standards versetzt und mittels LLE und automatisierter SPME extrahiert (50 ml bzw. 20 ml). An ausgewählten Probenahmetagen wurden Wasserproben an ein Partnerlabor versendet, um die Reproduzierbarkeit der SPME-Analytik in einem Laborvergleich zu prüfen [5].

Bild 2. Konzentrationen hydrophober organischer Chemikalien in der Wasserphase im Verlauf von Biokonzentrationsstudien. Durchgehende Linien zeigen die zeitlich gewichteten mittlere Konzentrationen in der Wasserphase ± 20 % (gestrichelte Linien), Fehlerbalken zeigen Standardabweichung. a) Vergleich von SPME (schwarz) und LLE (grau) für die Bestimmung von Gesamtgehalten (Cw,t) am Beispiel von Hexachlorbenzol (n = 2 – 4). b) Laborvergleich der Gesamtgehalte (Cw,t) von o-Terphenyl nach Probentransport und Extraktion mit SPME (Labor 1: gefüllte Kreise, Labor 2: offene Kreise, durchgehende Linien für beide Labore sind überlappend) (n = 2 – 4). c) PCB 153-Konzentrationen nach Extraktion von Gesamtgehalten durch LLE (grau) und SPME (schwarz) sowie frei gelöster Konzentrationen mit SPME (grün) (n = 2 – 8). [5]. (Bild: Leonard Böhm)

Gleichwertigkeit von LLE und SPME bei den Gesamtgehalten
Die vergleichende Extraktion von HOC-Konzentrationen aus der Wasserphase der BCF-Studien mittels LLE und SPME führte bei Verwendung interner Standards zu Gesamtgehalten gleicher Höhe. Bild 2a zeigt dies beispielhaft für Hexachlorbenzol (HCB). Der Laborvergleich nach Probenversand führte zu identischen Messergebnissen für alle untersuchten Substanzen, was in Bild 2b am Beispiel von o-Terphenyl dargestellt ist. Für die Testsubstanzen ergaben sich basierend auf ihren Konzentrationen im Fisch und ihren Gesamtgehalten in der Wasserphase BCF-Werte zwischen 10 000 und 30 000.

Einfluss organischer Substanz auf bioverfügbare Konzentrationen
Die Ergebnisse der systematischen Sorptionsstudien im Labor ließen auf einen hohen Einfluss der untersuchten organischen Substanz auf die freien HOC-Konzentrationen schließen. Für die Sorption der HOC an Fischfutter und den Filterrückstand eines Kontrollbeckens (enthält v.a. Ausscheidungen und Futterreste) konnten hohe Sorptionskoeffizienten bestimmt werden, die in ihrer Höhe von den Moleküleigenschaften der HOC und der Zusammensetzung der organischen Substanz abhängig waren [4].

Die Sorption der HOC an organische Substanz wurde auch in den BCF-Studien beobachtet, sie fiel jedoch geringer aus als in den systematischen Sorptionsstudien. Dies wurde mit der unterschiedlichen Zusammensetzung der organischen Substanz in den jeweiligen Studien erklärt. Die Bestimmung der frei verfügbaren HOC-Konzentrationen mittels SPME war im unteren ng l−1-Bereich möglich. Für das polychlorierte Biphenyl (PCB) 153 wurde im Vergleich mit der Gesamtkonzentration eine signifikant verringerte frei gelöste bzw. bioverfügbare Konzentration gemessen (Bild 2c).

Bild 3. Schematische Darstellung der automatisierten SPME. a) GC/MS mit Autosampler und SPME-Ausrüstung (Halterung für 20 ml-Gefäße, Faser-Halterung im Autosampler-Arm, Ofen mit horizontaler Schüttel-Funktion), b) SPME-Extraktion direkt aus der Probe bzw. aus dem Gasraum über der Probe, c) wiederverwendbare Fasern mit verschiedenen Beschichtungsmaterialien und -volumina, d) mikroskopische Vergrößerung einer Faser außerhalb der Schutzkanüle, e) Faserhalter für den Autosampler [9]. (Bild: Leonard Böhm)

Die Berücksichtigung der im Testsystem frei gelösten Konzentration bei der Berechnung des BCF-Werts führte im Fall von PCB 153 zu einem deutlichen Anstieg des ermittelten BCF-Wertes von ca. 17 000 auf ca. 28 000, was einer Erhöhung um ca. 65 % entspricht. Dieser Anstieg zeigt den hohen Einfluss selbst niedriger Konzentrationen organischer Substanz im Testsystem (hier 6 mg TOC l-1), kann jedoch nicht allein die in der Vergangenheit häufig beobachteten verringerten BCF-Werte oberhalb von log KOW 5–6 („hydrophobicity cutoff“) durch den Einfluss von organischer Substanz erklären, sondern weist auf die Relevanz weiterer, vermutlich physiologischer Einflussfaktoren hin.

Einordnung und regulatorischer Ausblick
Die Ermittlung von Gesamtgehalten ist regulatorisch weiterhin gefordert, nicht zuletzt um die Vergleichbarkeit neuer mit bestehenden Datensätzen zu gewährleisten. Auf Grundlage der vorliegenden Ergebnisse kann die Verwendung der automatisierten SPME mit internen Standards anstelle der LLE als Extraktionsmethode für die Bestimmung von Gesamtgehalten wässriger HOC-Konzentrationen ohne Einschränkungen empfohlen werden. Die Verwendung der SPME erlaubt dabei die Einsparung (toxischer) Lösungsmittel.

Im Vergleich zur LLE ergibt sich durch die automatisierte SPME darüber hinaus ein deutlich verringerter Arbeitsaufwand für die Extraktion. Da die Verwendung der SPME die parallele Bestimmung bioverfügbarer Konzentrationen ermöglicht, steht ohne zusätzlichen experimentellen Aufwand ein Parameter zur Interpretation der Genauigkeit der zu bestimmenden BCF-Werte zur Verfügung. Die mittels automatisierter SPME gemessenen bioverfügbaren Konzentrationen sind jedoch aufgrund von Methodik-inhärenten Einflussfaktoren einer größeren Streuung unterworfen als die Gesamtgehalte.

Da die zur Probe dotierten internen Standards an die organische Substanz binden, führt ihre Verwendung zur Korrektur der Messergebnisse zwangsläufig zur Bestimmung von Gesamtgehalten. Ihr Einsatz ausschließlich zur Korrektur potentiell auftretender Faseralterung bzw. Schwankungen in der Stabilität des GC/MS-Systems ist daher nicht möglich. Darüber hinaus kann bei der Extraktion von Spurenkonzentrationen die gemessene frei gelöste Konzentration durch zu kurze oder zu lange Extraktionszeiten in gewissem Umfang beeinflusst werden [5].

Die Genauigkeit der frei verfügbaren Konzentrationen lässt sich durch Anwendung der SPME in situ erhöhen, geht jedoch gegenüber der automatisierten SPME mit einem erhöhten Arbeitsaufwand einher. Aus diesem Grund wird die Messung mittels automatisierter SPME und Erfassung der bioverfügbaren Konzentrationen als Screening empfohlen, um den Einfluss von organischer Substanz im Testsystem auf die Ermittlung der BCF-Werte abschätzen zu können. Die Ergebnisse unterstreichen die Notwendigkeit studienbegleitend stets für eine Reduzierung des TOC-Gehalts im Testsystem zu sorgen, beispielsweise durch erweiterte Reinigungsmaßnahmen in den Becken wie das Absaugen von Futterresten und von Ausscheidungen der Fische.

Basierend auf den Studienergebnissen wurde die SPME bei der Revision der OECD-Richtlinie 305 berücksichtigt und zur Messung von HOC empfohlen. Darüber hinaus fanden die Ergebnisse Eingang in ein Guidance Document zur Ergänzung der OECD-Richtlinie 305 [6].

Fazit
Die Festphasenmikroextraktion (SPME) kann bei der Wasseranalytik gegenüber der lösungsmittelbasierten Flüssig-Flüssig-Extraktion (LLE) mit deutlichen Vorteilen punkten. Die Extraktion mit beiden Verfahren führte zu identischen Gesamtgehalten. Darüber hinaus ermöglicht die automatisierte SPME die parallele Bestimmung frei gelöster Konzentrationen und bietet somit wertvolle Zusatzinformationen für die Interpretation der Daten, bzw. um die Validität der Ergebnisse hinsichtlich bioverfügbarer Konzentrationen zu erhöhen.

Literatur
[1] Organisation for Economic Co-operation and Development. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 3, Degradation and Accumulation. Test No. 305: Bioaccumulation in Fish: Aqueous and Dietary Exposure. DOI: 10.1787/2074577x.
[2] Bondarenko S, Gan J. 2009. Simultaneous measurement of free and total concentrations of hydrophobic compounds. Environmental Science & Technology 43: 3772–3777. DOI: 10.1021/es8037033.
[3] Schlechtriem C, Böhm L, Bebon R, Bruckert H-J, Düring R-A. 2017. Fish bioconcentration studies with column generated analyte concentrations of highly hydrophobic organic chemicals. Environmental Toxicology and Chemistry 36: 906–916. DOI: 10.1002/etc.3635. Open access.
[4] Böhm L, Schlechtriem C, Düring R-A. 2016. Sorption of highly hydrophobic organic chemicals to organic matter relevant for fish bioconcentration studies. Environmental Science & Technology 50: 8316–8323. DOI: 10.1021/acs.est.6b01778. Open access.
[5] Böhm L, Düring R-A, Bruckert H-J, Schlechtriem C. 2017. Can solid-phase micro-extraction replace solvent extraction in fish bioconcentration studies for highly hydrophobic organic chemicals? Environmental Toxicology and Chemistry 36: 2887–2894. DOI: 10.1002/etc.3854. Open access.
[6] Organisation for Economic Co-operation and Development, Series on Testing & Assessment No. 264: Guidance Document on Aspects of OECD TG 305 on Fish Bioaccumulation. Paris, 2017 [ENV/JM/MONO(2017)16].
[7] Arthur CL, Pawliszyn J. 1990. Solid phase microextraction with thermal desorption using fused silica optical fibers. Analytical Chemistry 62: 2145–2148. DOI: 10.1021/ac00218a019.
[8] Ouyang G, Jiang R (Hrsg.) Solid Phase Microextraction. Recent Developments and Applications. 2017. Springer-Verlag Berlin.
[9] Böhm L. 2017. Solid-phase microextraction in ecotoxicological testing – progress with regard to highly hydrophobic organic chemicals in bioconcentration
experiments. Justus-Liebig-Universität Gießen.

AUTOREN

Dr. Leonard Böhm
Leonard.Boehm@envr.jlug.de 

Prof. Dr. Rolf-Alexander Düring
Justus-Liebig-Universität Gießen

Prof. Dr. Christian Schlechtriem
Fraunhofer IME Schmallenberg


Die Festphasenmikroextraktion (SPME)
Die Festphasenmikroextraktion (solid-phase microextraction, SPME) [7, 8] (Bild 3) ist ein miniaturisiertes, lösungsmittelfreies, nicht-erschöpfendes Extraktionsverfahren, welches auf der Verteilung einer Substanz zwischen der Probe und einer beschichteten Faser basiert. Die Faser-gestützte Extraktion der Proben kann sowohl manuell, als auch automatisiert durchgeführt werden. Bei der automatisierten Variante ist die Faser in einen Autosampler integriert und direkt mit einem GC/MS-System gekoppelt. Die Extraktion findet hier zeitlich überwacht bei für die jeweilige Untersuchung anzupassenden Faserbeschichtungen, Temperaturen und Schüttelgeschwindigkeiten statt. Typische Extraktionszeiten liegen zwischen wenigen Minuten bis zu einer Stunde, abhängig von Fragestellung und Konzentrationsbereich.

Den Anwendungsmöglichkeiten der SPME sind kaum Grenzen gesetzt: Leicht bis schwerflüchtige organische Chemikalien (von Schadstoffen bis Naturstoffen) lassen sich nach Anpassung der Methoden aus verschiedensten, auch komplexen Matrizes extrahieren (z. B. Wasser, Boden, Luft, Spielzeug, Lebensmittel, Klärschlamm). Genormte Methoden stehen beispielsweise mit den DIN EN ISO Normen 27108 und 17943 zur Bestimmung ausgewählter Pflanzenschutzmittel und Biozidprodukte bzw. flüchtiger organischer Verbindungen zu Verfügung.

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