Raman-Mikroskopie für die Partikelanalyse

Mikropartikel in komplexen Proben

Die Charakterisierung von Mikropartikeln in unterschiedlichen und zum Teil komplexen Proben stellt eine analytische Herausforderung dar, die in vielen Laboren gemeistert werden muss. Neben strukturellen Eigenschaften wie Größe und Form ist dabei auch die chemische Zusammensetzung der Partikel von Interesse. Diese kann mit Raman-Spektroskopie bestimmt werden. Automatisierte und detaillierte Partikelanalysen sind mit Hilfe eines konfokalen Raman-Mikroskops und einer speziellen Software möglich. Im Folgenden werden verschiedene Anwendungen mit Untersuchungsergebnissen beschrieben.
© WITec

Mikropartikel haben in vielen Bereichen nützliche Anwendungen, zum Beispiel in Kosmetik, Medizin und Materialwissenschaften. Andererseits wird die Zunahme von Mikroplastik in der Umwelt mit wachsender Sorge betrachtet. Daher sind Mikropartikelanalysen für viele Labore relevant. Bevor die Probe näher untersucht werden kann, muss sie zunächst sorgsam entnommen und aufbereitet werden [1]. Bei der mikroskopischen Untersuchung im Labor ist eine weitreichende Automatisierung aller Arbeitsschritte vorteilhaft, denn sie beschleunigt und standardisiert den Arbeitsablauf. Zum einen müssen große Probenbereiche erfasst werden, um statistisch relevante Daten zu erhalten. Zum anderen müssen selbst kleine Partikel zuverlässig erkannt werden. Oft ist nur ein Bruchteil der gefundenen Teilchen für eine weiterführende Analyse von Interesse und diese müssen anhand struktureller Eigenschaften wie Größe und Form selektiert werden. Raman-Spektroskopie und Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie (FTIR) sind häufig verwendete Methoden für die chemische Identifizierung der Partikel [1, 2]. Beide Methoden beruhen auf der Anregung und Detektion von Molekülschwingungen und identifizieren Substanzen anhand ihrer individuellen Spektren. Sie sind zerstörungsfrei und teilweise komplementär, wobei Raman-Spektroskopie für die Untersuchung wässriger Proben und kleiner Partikel besser geeignet ist als FTIR [1, 2]. Die Identifikation der Teilchen anhand ihrer Spektren wird durch die Verwendung einer umfangreichen Datenbank-Software erleichtert. Schließlich ermöglicht die Korrelation chemischer und struktureller Eigenschaften eine detaillierte Analyse der Probenzusammensetzung.

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Automatisierte Partikelanalyse mit Raman-Mikroskopie

Eigens für Partikelanalysen mit Raman-Mikroskopie hat man bei Witec eine spezielle Software entwickelt: Mit Hilfe der Software „ParticleScout“ eines konfokalen Witec-Raman-Mikroskops der „alpha300“-Serie können sämtliche Schritte einer umfassenden Partikelanalyse weitgehend automatisch durchgeführt werden. Im Folgenden werden die Möglichkeiten dieser Kombination anhand von Anwendungsbeispielen aus Pharmazie, Kosmetik und Umweltwissenschaften vorgestellt.

Mikropartikel in Kosmetika

Manche Kosmetika erhalten die gewünschten Eigenschaften durch Mikropartikel. Hier wurde eine kosmetische Creme dünn auf einem Objektträger ausgestrichen. Ein großflächiges Hellfeldbild (3 x 3 mm) entstand, indem benachbarte Bildausschnitte zusammengefügt wurden (Image Stitching). Die Tiefenschärfe wurde durch Kombination mehrerer Bilder aus verschiedenen Fokusebenen erhöht (Focus Stacking), so dass Partikel unterschiedlicher Größe vollständig scharf abgebildet werden (s. Bild 1, links). Die kristallinen Partikel erscheinen im Hellfeldbild hellblau und die Matrix dunkelgrau. Die Software „ParticleScout“ erkannte im untersuchten Probenbereich fast 4 000 Partikel, deren Raman-Spektren automatisch gemessen wurden. In dieser Software ist zur Identifizierung der Spektren die Datenbank-Software „TrueMatch“ integriert. Die Creme besteht demnach hauptsächlich aus Anatas- und Bornitrid-Partikeln in einer Öl-Matrix. Anatas, eine Form von Titandioxid, wird oft als weißes Pigment verwendet, während Bornitrid für die feuchtigkeitsspendende Wirkung und geschmeidige Konsistenz vieler Kosmetika sorgt. Physikalische Parameter wie Umfang und Äquivalentdurchmesser wurden für alle Teilchen berechnet und mit den Materialeigenschaften korreliert. Beispielsweise zeigt das Histogramm der Projektionsfläche, dass die Anatas-Partikel statistisch größer sind als die Bornitrid-Teilchen (s. Bild 1, rechts).

Bild 1: Analyse einer kosmetischen Creme. Links: Hellfeldbild mit überlagertem Raman-Bild (Ausschnitt des untersuchten Probenbereichs). Das Raman-Bild zeigt die Verteilung der drei Komponenten Anatas (orange), Bornitrid (grün) und Öl (blau), die anhand ihrer Spektren identifiziert wurden. Da die Creme sehr dünn ausgestrichen wurde, ist an einigen Stellen nur das Glassubstrat zu sehen (grau im Raman-Bild, hellgrau im Hellfeldbild). Grafik rechts: Größenverteilung der Anatas- und Bornitrid-Teilchen. © Witec

Zudem wurde ein vollständiges Raman-Bild eines kleinen Probenbereichs aufgenommen und dem Hellfeldbild überlagert (Bild 1, links). Es veranschaulicht die räumliche Verteilung aller Creme-Komponenten, allerdings würde es viel zu lange dauern, den kompletten Probenbereich auf diese Art zu analysieren. Durch die gezielte Partikelanalyse können hingegen Tausende Partikel schnell untersucht werden.

Mikroplastik in Umweltproben

Bild 2: Detektion von Mikroplastikpartikeln in Klärschlamm. Der Klärschlamm wurde filtriert und die Partikel auf dem Filter analysiert. Dunkelfeldbild des ganzen Filters (links) und Vergrößerung des rot markierten Bereichs (rechts). Die Probe wurde von Dieter Fischer (Leibniz-Institut für Polymerforschung, Dresden) zur Verfügung gestellt. © Witec

Jedes Jahr gelangen Millionen Tonnen Mikroplastikpartikel in die Umwelt. Sie entstehen durch die Zersetzung von Plastikprodukten wie Verpackungsmaterial oder beim Waschen von synthetischer Kleidung. Aufgrund der oft komplexen Zusammensetzung von Umweltproben ist deren Analyse besonders anspruchsvoll und erfordert automatisierte und standardisierte Prozesse [1, 2]. Die hier untersuchte Klärschlammprobe (50 g) wurde aufbereitet und zweimal filtriert [3, 4]. Im Dunkelfeldbild eines Silizium-Filters (Porengröße 10 µm) wurden einige zehntausend Teilchen lokalisiert (Bild 2). Von den etwa 18 000 gemessenen Raman-Spektren wurden 46 durch die „ParticleScout“-Software als Mikroplastik identifiziert, was etwa 0,25 % entspricht. Die häufigsten Kunststoffarten waren hier Polyethylen (25 Partikel) und Polypropylen (12 Partikel). Außerdem wurden viele Pigmente und einige Titandioxid-Partikel gefunden. Der Äquivalentdurchmesser der Kunststoff-Teilchen lag im Bereich von 10 µm bis 100 µm. Mikroplastikpartikel dieser Größe können von diversen marinen Bioorganismen aufgenommen werden, und die möglichen Auswirkungen werden fortlaufend erforscht [1, 5].

Pharmazeutische Mikropartikel

Bild 3: Analyse eines pharmazeutischen Pulvers gegen Fieber und Schmerzen. Links: Flächenanteile der Inhaltsstoffe; rechts: Größenverteilung der Paracetamol- und Ethenzamid-Teilchen. © Witec

Für die Wirksamkeit von Medikamenten sind Zusammensetzung und Partikelgröße der enthaltenen Substanzen entscheidend [6]. Ein schmerzlinderndes und fiebersenkendes Pulver wurde auf einem Objektträger verteilt und mikroskopisch untersucht. Um einzelne Aggregate auszuschließen wurden Teilchen mit einem Durchmesser von weniger als 100 µm selektiert und die Raman-Spektren von mehr als 3 000 verbleibenden Partikeln gemessen. Die eingesetzte „ParticleScout“-Software hat eine Option zur Messzeitoptimierung für jedes Teilchen, so dass viele Hundert Partikel pro Stunde analysiert werden können. Das verwendete Mikroskop kann selbst kleine Partikel für die Raman-Messung exakt ansteuern. Hier wurden Teilchen ab einer Fläche von 1 µm² berücksichtigt. Die Mehrheit der Partikel bestand aus den schmerzlindernden Wirkstoffen Paracetamol und Ethenzamid. Zusätzlich waren Koffein als Wirkungsverstärker und Laktose als Trägerstoff enthalten. Weißes Pigment wurde ebenfalls detektiert. In Bild 3 stellt die linke Grafik die Flächenanteile der jeweiligen Teilchenarten dar. Die Grafik rechts im Bild vergleicht die Größenverteilung der beiden Wirkstoffe anhand ihres Äquivalentdurchmessers.

Zusammenfassung

Detaillierte Partikelanalysen stellen eine analytische Herausforderung dar, die in den beschriebenen Untersuchungen mit konfokaler Raman-Mikroskopie und mit Hilfe einer speziell entwickelten Software gemeistert werden konnte. Automatisierte Abläufe ermöglichen es, viele Partikel schnell zu lokalisieren, zu kategorisieren und anhand ihrer Raman-Spektren chemisch zu identifizieren. So kann die Probenzusammensetzung anhand von Partikeleigenschaften wie Größe, Form und Material umfassend untersucht werden. Die Anwendungsbeispiele aus Kosmetik, Pharmazie und Umweltwissenschaften zeigen die Stärken dieses Ansatzes für die Mikropartikelanalyse.

Referenzen
[1] N.P. Ivleva et al. (2017) Microplastic in aquatic ecosystems. Angew. Chem. Int. Ed. 56: 1720-1739. DOI: 10.1002/anie.201606957
[2] C.F. Araujo et al. (2018) Identification of microplastics using Raman spectroscopy: Latest developments and future prospects. Water Res. 142: 426-440. DOI: 10.1016/j.watres.2018.05.060
[3] A. Käppler et al. (2015) Identification of microplastics by FTIR and Raman microscopy: A novel silicon filter substrate opens the important spectral range below 1300 cm-1 for FTIR transmission measurements. Anal. Bioanal. Chem. 407: 6791-6801. DOI: 10.1007/s00216-015-8850-8
[4] K. Enders et al. (2020) When every particle matters: A QuEChERS approach to extract microplastics from environmental samples. MethodsX 7: 100784. DOI: 10.1016/j.mex.2020.100784
[5] S.L. Wright et al. (2013) The physical impacts of microplastics on marine organisms: A review. Environ. Pollut. 178: 483-492. DOI: 10.1016/j.envpol.2013.02.031
[6] T.F. Haefele, K. Paulus, Confocal Raman microscopy in pharmaceutical development. In: Confocal Raman Microscopy, J. Toporski, T. Dieing, and O. Hollricher (Editoren) Springer International Publishing AG, 2. Auflage (2018) p. 381-419. DOI: 10.1007/978-3-319-75380-5_16

AUTOREN
Miriam Böhmler, Keiichi Nakamoto, Karin Hollricher, Eleni Kallis
WITec GmbH, Ulm
Tel.: 0731/140 70 0
info@witec.de
www.witec.de

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