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Bestimmung hormoneller Aktivitäten im Wasser mit Hefezellenassays

Unkomplizierter Assay zur Bewertung des chemischen Zustands von WasserBestimmung hormoneller Aktivitäten im Wasser mit Hefezellenassays

Arxula adeninivorans-Hefezellenassays sind nicht nur für die Beurteilung der Qualität eines Oberflächengewässers oder zur Einleiterkontrolle geeignet, sondern z.B. auch zur Überwachung einer Kläranlage und zur Beurteilung einer vierten Reinigungsstufe. Die unkomplizierten Assays sind besonders für kleine Labore interessant, die keine aufwändige Zellkultivierung leisten können. Mit transgenen Varianten der Hefe A. adeninivorans können hormonell aktive Substanzen bestimmt werden.

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Hefezellenassays

Zur Bewertung des chemischen Zustands, d.h. der chemischen Zusammensetzung und des Stoffgehalts eines Gewässers, werden üblicherweise instrumentelle analytische Verfahren wie beispielsweise GC-MS oder LC-MS angewendet [1]. Diese Verfahren setzen voraus, dass die Stoffe bezüglich Struktur und chemischer Eigenschaften bekannt sind. Ein Nachteil dieses substanzorientierten Ansatzes ist jedoch, dass nur diejenigen Substanzen gemessen werden können, nach denen explizit gesucht wird. Gerade bei Wasserproben mit einer besonders komplexen Zusammensetzung können jedoch sehr viele Substanzen enthalten sein. Ein Non-Target-Screening, beispielsweise mittels hochauflösender Massenspektrometrie (HRMS), erfasst zwar alle ionisierbaren Substanzen, die Auswertung dieser großen Datensätze ist jedoch zeit- und personalintensiv und gibt keine Informationen über eine mögliche Wirkung. Eine Analyse aller (auch unbekannter) Einzelstoffe einer Probe ist somit kaum möglich. Eine weitere Herausforderung bei der Einzelstoff-analytik stellen die oftmals nur in Spuren (pg/l-Bereich) vorhandenen Stoffe dar [2].

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Insbesondere Hormone und hormonell aktive Substanzen wie z.B. Estron (E1), 17βEstradiol (E2), Estriol (E3) und 17αEthinyl-estradiol (EE2) zeigen bereits in sehr geringen Konzentrationen Auswirkungen auf die Umwelt [3]. Erst unterhalb einer Konzentration von 6, 2, 60 und 0,1 ng/l für die Substanzen E1, E2, E3 und EE2 sind Effekte auf aquatische Lebewesen unwahrscheinlich [4]. Zur Überwachung im Gewässer wurden einige dieser Substanzen auf die Beobachtungsliste („Watch list“) der europäischen Wasserrahmenrichtlinie aufgenommen. Hierbei liegen die geforderten Nachweisgrenzen für E1 und E2 bei 0,4 ng/l und für EE2 bei 0,035 ng/l [5]. Bislang ist keine Methode bekannt, die EE2 in Oberflächengewässern mit den notwendigen Nachweisgrenzen zuverlässig messen kann [6].

Östrogene (A) und androgene (B) Aktivität im Kläranlagenablauf

Es besteht jedoch die Möglichkeit, diese Substanzen über eine wirkungsbezogene Analytik zu erfassen. Dabei werden die Gesamt- aktivität einer Probe und somit auch unbekannte Substanzen bestimmt. Diese Testsysteme sind in der Lage, niedrigere Nachweisgrenzen als die instrumentelle Analytik zu erreichen. Hierzu werden hauptsächlich Rezeptor-Gen-Assays wie beispielsweise der A-Yes® (Arxula adeninivorans-Yeast Estrogen Screen; new diagnostics GmbH, Berlin, Deutschland) genutzt, der sich zurzeit im internationalen Normungsprozess befindet (ISO/FDIS 19040-2) [7]. Neben dem A-Yes, der die estrogene Wirkung einer Probe bestimmt, wird im Folgenden der A-Yas zur Bestimmung der androgenen Aktivität vorgestellt. Es sind ebenfalls Testsysteme zur Bestimmung der gestagenen (A-Yps®) Wirkung sowie der Nachweis der AhR (Aryl-Hydrocarbon-Rezeptor bspw. aktiviert durch Dioxine; A-Yds®) vermittelten Wirkung in Arxula adeninivorans verfügbar.

Phytase korrelliert mit Konzentration hormonell aktiver Substanzen
Alle diese Assays basieren auf transgenen Varianten der Hefe A. adeninivorans, die entsprechend dem Anwendungsbereich ein Rezeptorgen humanen Ursprungs enthalten. Der Aufbau und das Funktionsprinzip der transgenen Hefezelle ist in Bild 1 schematisch dargestellt.

In Anwesenheit eines Liganden wirkt der gebildete Rezeptor-Ligand-Komplex als Transkriptionsfaktor, wodurch ein Reportergen aktiviert und ein Reporterenzym gebildet wird. Dabei handelt es sich um das Enzym Phytase. Dieses wird in das extrazelluläre Medium abgegeben, und dessen Menge korreliert mit der Konzentration an hormonell aktiven Substanzen. Die Menge an Phytase kann anschließend nach enzymatischer Reaktion mit einem chromogenen Substrat photometrisch nachgewiesen werden. Die Gesamt-Wirkung der Proben wird dann im Verhältnis zur Wirkung der jeweiligen Referenzsubstanz als Äquivalentkonzentration angegeben. Für die östrogene Aktivität wird E2, für die androgene Aktivität 5α-Dihydrotestosteron (DHT) als Referenz verwendet. Das Ergebnis wird als E2-Äquivalente (EEQ) bzw. DHT-Äquivalente (DHTEQ) angegeben.

Die im Kit-Format mit einer standardisierten Arbeitsanweisung kommerziell erhältlichen Assays enthalten neben den gefriergetrockneten Hefen den Referenzstandard, alle benötigten Medien, Lösungen und Inkubationsplatten, sowie den Zugang zur standardisierten Auswerte-Software Bioval®.

Zusätzlich zum Kit benötigt der Anwender für die Durchführung lediglich ein gentechnisches S1-Labor, einen temperierbaren Schüttler und eine Zentrifuge für Deepwell-Platten. Empfohlen werden zur Minimierung des Pipettieraufwands außerdem Mehrkanalpipetten. Ein steriles Arbeiten in einer Werkbank ist für diesen Test nicht erforderlich.

Bewährte Anwendung auch in schwierigen Abwassermatrizes
Die A. adeninivorans-Hefezellenassays können für wässrige Proben eingesetzt werden. Das Verfahren wurde im Rahmen der ISO-Standardisierung validiert und ist für Trinkwasser, Oberflächenwasser, Brackwasser, Meerwasser, wässrige Eluate und wässrige Substanzgemische anwendbar [7]. Darüber hinaus wurden auch in unterschiedlichen Abwassermatrizes gute Ergebnisse erzielt. In den meisten Proben war eine sichere Quantifizierung mit einer geringen Nachweisgrenze möglich. Auch in einer der schwierigsten Matrizes im Umweltbereich, in Proben von Kläranlagenzuläufen, konnte mit den A. adeninivorans-Hefezellenassays eine Bestimmung der hormonellen Aktivität durchgeführt werden. Hier konnten, wie erwartet, auch Matrixeffekte beobachtet werden.

Somit sind die A. adeninivorans-Hefezellenassays nicht nur für die Beurteilung der Qualität eines Oberflächengewässers oder zur Einleiter-Kontrolle geeignet, sondern z.B. auch zur Überwachung einer Kläranlage und zur Beurteilung einer vierten Reinigungsstufe. Bild 2 zeigt die estrogene (Teil A) und androgene (Teil B) Aktivität in Proben eines Kläranlagenablaufs und nach zwei großtechnischen Ozonanlagen. Alle Proben wurden zunächst mittels Festphasenextraktion (Oasis HLB, Waters, Eschborn, Deutschland) angereichert. Die Extrakte wurden anschließend im A-Yes- und A-Yas-Assay untersucht. Dieses Beispiel zeigt, dass mit Hilfe der A. adeninivorans-Hefezellenassays auch die hormonelle Aktivität von extrahierten Proben bestimmt werden kann. Außerdem ist es möglich, die estrogene Aktivität in dem Konzentrationsbereich zu bestimmen, ab dem eine Wirkung auf aquatische Lebewesen möglich ist.

Auch für die Untersuchung von Oberflächengewässern im Hinblick auf die europäische Wasserrahmenrichtlinie bieten die A. adeninivorans-Hefezellenassays einige Vorteile. Hier wird die Untersuchung der Gesamtheit der Probe, d. h. ohne vorherige Filtration, gefordert [8, 9]. Auch diese partikelhaltigen Proben können mit den Assays problemlos analysiert werden. Zum einen liegt dies an dem verwendeten Enzym Phytase, das zu 97 % im Zellmedium vorliegt und somit einfach zur photometrischen Messung von den Partikeln durch Zentrifugation abgetrennt werden kann. Zum anderen ist bei anderen Testsystemen eine Filtration zur Sterilisation der Proben notwendig. Auch dies entfällt bei den A. adeninivorans-Hefezellenassays.

Neben der Analyse der estrogenen und androgenen Aktivität können der A-Yes und der A-Yas auch zur Bestimmung der anti-estrogenen und anti-androgenen Aktivität verwendet werden. Dazu wird die Reduktion des Messsignals einer dotierten Probe ausgewertet. Antagonistische Substanzen in der Probe hemmen die Detektion der dotierten Agonisten und können über eine entsprechende Kalibration quantifiziert werden [10]. Diese antagonistischen Effekte sind für aquatische Lebewesen ebenfalls von Bedeutung da sie genau wie agonistische Substanzen das Gleichgewicht des Hormonsystems stören können [11].

Eine weitere Anwendung dieser Assays, die sich zurzeit noch in der Entwicklung befinden, ist die Kombination mit der Hochleistungsdünnschichtchromatographie (HPTLC). Hierbei werden Substanzen zunächst auf der HPTLC aufgetrennt und anschließend estrogen oder androgen aktive Spots mit Hilfe der A. adeninivorans-Assays identifiziert. Auf diese Weise können in einer Methode Informatio-nen über Substanzen und deren Wirkung erhalten werden.

Langzeitlagerung der Zellen möglich; steriles Arbeiten nicht notwendig
Im Vergleich zu den zwei weiteren, am häufigsten genutzten Assays zur Bestimmung der estrogenen und androgenen Aktivität, dem Yes/Yas sowie dem ER /AR Calux [12-15], zeigen sich einige weitere Vorteile der A. adeninivorans-Assays. Aufgrund der Verwendung von gefriergetrockneten Hefezellen können die Zellen über einen Zeitraum von bis zu sechs Monaten ohne Aktivitätsverlust gelagert werden. Eine regelmäßige Zellvermehrung ist nicht notwendig. Dies spart nicht nur Personal- und Laborkapazität, sondern stellt auch die Qualität der im Test eingesetzten Hefezellen sicher. Außerdem ist es mit den A. adeninivorans-Zellen möglich, den kompletten Test unter nicht-sterilen Bedingungen durchzuführen, da in Abwässern oder Umgebungsluft vorhandene Mikroorganismen das Hefezellenwachstum und die Messwerte in der Regel nicht beeinflussen. Dies macht die A. adeninivorans-Assays insbesondere für kleinere Labore interessant, die keine aufwändige Zellkultivierung leisten können. Die ebenfalls enthaltene Standardarbeitsanweisung ermöglicht schon nach kurzem Training (mit ein bis zwei Assays) eine sichere und valide Durchführung des Tests, die durch die spezielle Auswerte-Software zusätzlich unterstützt wird.

In einer vergleichenden Studie mit diesen drei Testsystemen wurde deutlich, dass die A. adeninivorans-Assays die höchste Robustheit gegenüber der Matrix eines Krankenhausabwassers aufwiesen [10]. Es zeigte sich auch, dass die Calux-Systeme am empfindlichsten gegenüber Matrixeffekten und mikrobiologischen Kontaminationen waren. Die S. cerevisiae-Assays sind robuster gegenüber den Proben, waren jedoch nicht in der Lage, alle Proben aus dem Kläranlagenzulauf zu quantifizieren. Lediglich mit den A. adeninivorans-Assays konnten alle Proben ohne Matrixeffekte quantifiziert werden. Trotz der unterschiedlichen Empfindlichkeiten kamen alle drei Assays zu einer gleichen Bewertung [10].

Ein weiterer Faktor im Vergleich von verschiedenen Assays ist die kurze Versuchsdauer der A. adeninivorans-Assays. Von der Reaktivierung der Zellen bis zur Auswertung der Ergebnisse werden hier ca. 28 Stunden benötigt. Für die S. cerevisiae-Assays bzw. die Calux-Systeme sind zwei bis drei Tage erforderlich [12, 14].

Fazit
Durch den geringen Labor- und Personalauf- wand und die kurze Testdauer sind die A. adeninivorans-Assays einfach in ein rein analytisch ausgerichtetes Labor zu integrieren und ohne große Investitionen zu etablieren. Somit ist dieser Assay insbesondere für kleine Labore ohne kostenintensive Infrastruktur für biologische Arbeiten besonders geeignet. Die Assays sind auch von Vorteil, wenn eine komplexe oder unbekannte Matrix untersucht werden soll oder die Aktivität im Vorfeld nicht abgeschätzt werden kann. Dies ist vor allem bei Abwässern der Fall, da es sich um sehr inhomogene Matrizes handelt, deren Zusammensetzung und Konzentration stark zwischen einzelnen Probennahmen variiert.


Literatur
[1] Santos L. H. M. L. M., Araujo A. N., Fachini A., Pena A., Delerue-Matos C., Montenegro M. C. B. S. M. (2010) J Haz Mat 175: 45-95
[2] Loos R. (2013) European Commission Joint Research Centre Technical Reports
[3] Kidd, K. A., Blanchfield P. J., Mills K. H., Palace V. P., Evans R. E., Lazorchak J. M., Flick R. W. (2007). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 104(21): 8897-8901.
[4] Caldwell, D. J., F. Mastrocco, P. D. Anderson, R. Lange and J. P. Sumpter (2012). Environmental Toxicology and Chemistry 31(6): 1396-1406.
[5] Commission implementing Decision (EU) 2015/495 of March 2015.
[6] Tuerk, J., Gehrmann L., Itzel F., Hetzel T., Posch T. N., Teutenberg T. (2016) Möglichkeiten und Grenzen bei der instrumentellen und wirkungsbezogenen Analytik von Hormonen. 2. Mülheimer Wasseranalytisches Seminar 14. - 15.09.2016
[7] Hettwer, K., Jähne, M., Frost, K., Giersberg, M., Kunze, G., Trimborn, M., Reif, M., Türk, J., Gehrmann, L., Dardenne, F., De Croock, F., Abraham, M., Schoop, A., Waniek, J.J., Bucher, T., Simon, E., Vermeirssen, E., Werner, A., Hellauer, K., Wallentits, U., Drewes, J.E., Dietzmann, D., Routledge, E., Beresford, N., Zietek, T., Siebler, M., Simon, A., Bielak, H., Hollert, H., Müller, Y., Harff, M., Schiwy, S., Simon, K. and Uhlig, S. (2018). Science of The Total Environment, 621: 612- 625.
[8] Directive 2000/60/EG of the European Parliament and of the Council of 23 October 2000 establishing a framework for Community action in the field of water policy. 2000
[9] European Commission: Common inplementation strategy for the water framework directive (2000/60/EC): Guidance on surface water chemical monitoring under the water framework directive. Guidance Document No. 19; 2009-025. 2009.
[10] Gehrmann, L., Bielak H., Behr M., Itzel F., Lyko S., Simon A., Kunze G., Dopp E., Wagner M., Tuerk J. (2016) Environmental Science and Pollution Research. doi:10.1007/s11356-016-7165-4: p. 1-11.
[11] Jobling, S., Burn R. W., Thorpe K., Williams R., Tyler C. (2009). Environmental Health Perspectives 117(5): 797-802.
[12] Legler, J., van den Brink C. E., Brouwer A., Murk A. J., van der Saag P. T., Vethaak A. D., van der Burg P. (1999) Toxicological Sciences 48(1): p. 55-66.
[13] Sonneveld, E., Jansen H. J., Riteco J. A. C., Brouwer A., van der Burg B. (2005) Toxicological Sciences. 83(1): p. 136-148.
[14] Routledge, E. J.,. Sumpter J. P (1996) Environmental Toxicology and Chemistry. 15(3): p. 241-248.
[15] Sohoni, P., Sumpter J. P. (1998) Journal of Endocrinology. 158(3): p. 327-339.

Autoren
Linda Gehrmann1, Fabian Itzel1,2, Karina Hettwer3, Kirsten Simon4, Steffen Uhlig3, Gotthard Kunze5, Thorsten Teutenberg1, Jochen Türk1,2

  • 1 Institut für Energie- und Umwelttechnik e. V. (IUTA), Bliersheimer Str. 58-60, 47229 Duisburg
  • 2 Zentrum für Wasser- und Umweltforschung (ZWU), Universität Duisburg-Essen, Universitätsstr. 2, 45117 Essen
  • 3 QuoData GmbH Quality & Statistics, Prellerstraße 14, 01309 Dresden
  • 4 new_diagnostics GmbH, Fabeckstr. 43, 14195 Berlin
  • 5 Leibniz-Institut für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung (IPK), OT Gatersleben, Corrensstraße 3, 06466 Seeland
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