"Tuning" und Veredelung von chromatographischen Analysenverfahren durch isotopenmarkierte interne Standards

Von klassischen Methoden zur Stabilisotopenverdünnungsanalytik

Wolfgang Brodacz*) AGES Österreichische Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit, Institut f. Lebensmittelsicherheit - Kontaminantenanalytik, Linz, E-Mail: wolfgang.brodacz@ages.at.

Retentionszeit-Shift durch Isotopeneffekt bei der Deuterierung (d5-Atrazin = schwarz vs Atrazin = grün + braun) bzw. 13C-Markierung ohne Verschiebung (vollständig gelabelts T-2 = rot vs natives T-2 = grün + blau + schwarz); (Darstellung der SIM-Spuren von Target T mit Qualifiern Q1-2).

Isotopenmarkierte Substanzen sind aufgrund praktisch gleicher physikalisch/chemischer Eigenschaften die idealen internen Standards. Die Stabilisotopenverdünnungsanalytik SIVA (engl. SIDA; Stable Isotope Dilution Analysis) wird damit zum Königsweg in der massenspektrometrischen Quantifizierung. Wie man am einfachsten von klassischen Methodenstrukturen zur SIVA gelangt und trotz wesentlicher Qualitätsverbesserung beim Verbrauch der kostbaren Standards sparen kann, zeigen einige Beispiele.

Eine klassische Premium-Limousine kann durchaus mit ausgereifter und zuverlässiger Technik aufwarten. Nach einer "Überarbeitung" durch einen Edeltuner spielt die Performance dann allerdings in einer wesentlich höheren Liga. Schließlich ist das Bessere der Feind des Guten. In der Welt der analytischen Methoden drängt sich als hoch effizientes Tuning die Steigerung der Selektivität bei der Detektion auf, d.h. Veredelung der Endbestimmung mit einem Massenspektrometer oder Erweiterung eines solchen zu einem Tandem-MS ("hyphenated method", MS-MS). Um beim automobilen Vergleich zu bleiben, wären dies die leistungssteigernden Maßnahmen am Motor (Turboaufladung, variable Nockenwellen, Kennfeldoptimierung via "Chip-Tuning", etc.). Um den Power-Zuwachs auch in echten Vortrieb umzuwandeln, muss die Kraft auch auf die Straße gebracht werden, und die Konkurrenz abhängen kann man nur mit einer perfekten Fahrwerksabstimmung. Dieses umfassende Gesamt-Tuning mit Aufwertung zum Allradantrieb mit Torque Vectoring entspricht der Umstellung einer klassischen Methode zur SIVA, deren Voraussetzung wiederum die MS-Detektion ist. Denn der gewünschte Umbau mittels "SIVA-Performance-Packet" ist ebenso wie in der Autowelt nicht als "Schnäppchen" zu haben. Besonders wenn man von komplexen und aufwendigen Methoden ausgeht, sind umfangreichere Adaptierungen und höhere Folgekosten fällig.

Die einfachste Variante wurde in LABO 5/2012 aufgezeigt [1]. Der "Dilute & Shoot"-Ansatz entspricht schon von der Ausgangssituation einem puristischen Sportwagen, der durch die beschriebene Spezialtechnik auf Höchstleistung getrimmt wurde ("online SIVA"). Doch "Dilute & Shoot" ist speziellen Bedingungen vorbehalten und nicht immer möglich bzw. sinnvoll anwendbar.

Sollen, wie z.B. bei Kindernährmitteln üblich, extrem niedere Bestimmungsgrenzen erzielt werden, kann man oft auf spezielle Clean up-Verfahren und Anreicherungen nicht verzichten.

Bei Normmethoden z.B. darf ein vorgesehenes Reinigungsverfahren gar nicht umgangen werden. Gerade diese Clean ups und eventuelle Derivatisierungsschritte, etc. bedingen bei klassischen Methoden oft mehrere Aliquotierungen der weiterverarbeiteten Probenmenge. Sie sind bei klassischen Methoden durchaus sinnvoll und für eine gute Quantifizierungsprozedur oftmals großzügig ausgelegt (d.h. Aliquotierungen mit Vollpipetten und großen Messkolbenvolumen).

Bei einer nachträglichen Adaptierung zur SIVA und Dotierung der teuren Isotopenstandards vor solchen Abstufungen werden diese bisher sinnvoll angelegten Aliquotierungen allerdings zur enormen Kostenfalle.

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Isotopenmarkierung

Ausgelöst durch die rasche Zunahme von Massenspektrometern in der GC und HPLC besteht steigender Bedarf an isotopenmarkierten Standards. Zur Markierung (d.h. dem Einbau meist schwererer stabiler Isotope) bieten sich 13C-Atome und die Deuterierung an.

Während bei deuterierten Analyten unter ungünstigen Umständen ein Deuterium/Protonen-Austausch bei manchen Probenmatrizes stattfinden kann, ist die 13C-Markierung in wässrigen Medien haltbarer, aber mit höherem Herstellungsaufwand verbunden. Bei der Deuterierung wird die Masse des substituierten Elements um 100 %, beim Austausch von 12C durch 13C nur um 8 % erhöht. Die Änderungen führen zu entsprechenden Differenzen bei den Reaktionsgeschwindigkeiten. "C-H"-Bindungen reagieren ca. 6...10 mal schneller als vergleichbare "C-D"-Bindungen. Der Unterschied der Reaktionsgeschwindigkeit zwischen 12C und 13C-Bindungen mit Wasserstoff beträgt lediglich 4 %, obwohl in beiden Fällen mit nur einem Dalton derselbe Massenunterschied besteht. Das daraus resultierende unterschiedliche Verhalten von nativen und markierten Analyten wird als Isotopeneffekt bezeichnet. Er ist bei der Deuterierung deutlich stärker ausgeprägt. Praktisch macht sich dieser Effekt z.B. bei der Kapillar-GC dadurch bemerkbar, dass deuterierte PAHs bzw. d5-Atrazin von den ursprünglichen Zielanalyten chromatographisch getrennt werden können.

Bild 1 zeigt, dass schon 5 Dalton Massenunterschied bei d5-Atrazin auf unpolaren Kapillarsäulen zu einer deutlichen Reduktion der Retentionszeit gegenüber normalem Atrazin führen. Selbst das um 24 Dalton schwerere, voll 13C-markierte T-2-Toxin kann mit der hohen Trennleistung von GC-Kapillaren nicht vom nativen Mykotoxin T-2-Toxin separiert werden und eignet sich daher hervorragend als idealer interner Standard.

Das wichtigste Fundament der SIVA-Quantifizierung und ausschlaggebend für die vereinfachte Handhabung der gesamten Methode ist der Einsatz dieser isotopenmarkierten Substanzen als interne Standards. Die vielfältigen Vorteile kommen besonders dann zum Tragen, wenn die Dotierung der gelabelten Zielanalyten bei bzw. sofort nach der Extraktion erfolgt. Das praktisch identische Verhalten von Zielanalyten und 13C-markierten Analogen bei allen Verfahrensschritten ist der entscheidende Vorteil der SIVA. Damit sind alle nachfolgenden Arbeitsschritte quantitativ unter Kontrolle dieser optimalen internen Standards. Alle Verluste bei Transferschritten oder beim Clean up, Ungenauigkeiten beim Manipulieren mit sehr kleinen Volumen, Unregelmäßigkeiten beim Einengen oder Aliquotieren etc. werden automatisch ausgeglichen [2]. Besonders wenn vollständig 13C-markierte interne Standards verwendet werden, können selbst schwer kontrollierbare prä- und postchromatographische Matrixeffekte kompensiert werden.

Während die Deuterierungs-Variante unter Retentionszeitverschiebungen u. eventuellem Deuteriumaustausch bei manchen Probenmatrizes leidet, liegt der Nachteil bei der vollen 13C-Markierung lediglich auf der Kostenseite. Der hohe Preis für diese idealen internen Standards erfordern deshalb unbedingt Modifizierungen bei der Methodenstruktur, um die benötigten Mengen zu minimieren.

Für die anschließenden groben Überschlagsrechnungen wird von folgenden Annahmen ausgegangen: Die Kosten für einen voll 13C-markierten Standard (z.B. Mykotoxine) liegen bei ca. 600 € für 1,2 ml einer 25 µg/ml-Lösung (= 30 µg). Der Einfachheit halber und für die Vergleichbarkeit wird angenommen, dass die Sensitivität bei GC/MS und LC/MS-MS gleich ist (hängt tatsächlich sehr stark vom Analyten ab). Es wird auch davon ausgegangen, dass bei allen Methoden 5 µl einer Messlösung von 100 ng/ml injiziert wird (d.h. 0,5 ng Reinsubstanz gelangen auf die Säule). Auch diesen Parameter kann man in der Praxis stark variieren (GC: 1...5 µl, bei Large Volume Injection auch wesentlich mehr möglich; LC: 5...100 µl). Als Einwaage wurden für Rückstandsanalysen praxisnahe 25 g und als Volumen für das Extraktionsmittel 100 ml gewählt.

Klassische Methodenstruktur mit SIVA

Als Ausgangspunkt wurde als Beispiel bewusst eine klassische und komplexe GC-Rückstandsmethode mit Clean up und Derivatisierung gewählt. Sie wurde für die Bestimmung von Trichothecen-Mykotoxinen entwickelt und hat sich über zwei Jahrzehnte in der Routinepraxis des Autors bewährt. Ein Entwicklungsschwerpunkt war, hohe Flexibilität für Wiederholanalysen aus verschiedenen Stadien der Aufarbeitung sicherzustellen, bzw. die Nutzung von Aliquoten des Rohextraktes oder des gereinigten Extraktes nach dem universellen Clean up auch für andere Mykotoxin-Gruppen oder verwandte Analyten zu gewährleisten. Zugunsten einer möglichst hohen Präzision aller Teilschritte wurde damals speziell darauf geachtet, mit ausreichend großen Aliquotierungen zu arbeiten (Liquid Handling mit Vollpipetten und Messkölbchen, etc.). Die Auswertemethode folgt der klassischen sog. externen Standardkalibrierung und ist daher auf präzise Flüssigkeitsvolumen in allen Stadien der Aufarbeitung angewiesen.

Die Zugabe des internen Standards sollte im Zeitablauf einer Analysenmethode grundsätzlich so früh als möglich erfolgen. Als Maximalforderung würde das bedeuten, dass sehr große Mengen an kostbaren Referenzsubstanzen direkt zur Einwaage dosiert werden müssten. Nur ein winziger Bruchteil würde dann tatsächlich zum Massenspektrometer gelangen, der Rest wäre pure Verschwendung. Denn die Extraktionseffizienz kann man mit den besten internen Standards nicht überprüfen. Das ist letztlich nur über den Umweg mit zertifizierten Matrix-Referenzmaterialien (CRM bzw. ERM®) möglich. Bei einer klassischen Methodenstruktur würde das bei unserem Beispiel völlig unakzeptable 2500 € pro Analyse kosten.

Damit würde man eigentlich nur die Kontrolle über relativ banale Aliquotierungsmanipulationen gewinnen, die ohnehin praktisch kein Problem sind. Um eine Zehnerpotenz günstiger ist die Dotierung eines 10 ml-Aliquotes des 100 ml Rohextraktes - mit praktisch derselben Aussagekraft (Bild 2 links).

Schon wesentlich wichtiger und dabei deutlich kostengünstiger ist die Kontrolle über ein eingesetztes Clean-up-Verfahren. Diese Reinigungsschritte sind immer kritische Punkte bezüglich Analytverlusten (Rückgewinnungsraten) und ihre Reproduzierbarkeit bedarf auch besonderer Aufmerksamkeit. Es ist also nur notwendig, kurz vor bzw. unmittelbar beim Clean up die gerade notwendige Menge an internem Standard zu investieren. Damit sind alle weiteren und potentiell problematischen Schritte unter optimaler Kontrolle des internen Standards. Bei unserem Methoden-Klassiker sind dafür allerdings noch immer 100 € fällig (auf eine detaillierte Aufschlüsselung wurde hier aus Platzgründen verzichtet; für eine aufgeschlüsselte Betrachtung siehe auch [3]).

Derivatisierungen kommen zum Glück meist nur bei komplexen GC-Methoden vor und sind sehr anspruchsvolle und aufwendige Probenmanipulationen. Wenn man sich auf die Kontrolle dieses Analysenschrittes beschränken kann, gewinnt man einen Kostenvorteilsfaktor von ca. 10. Beim alten Methodendesign bedeutet das noch immer ca. 10 € und inkludiert zumindest die Kompensation von GC-Injektionsschwankungen.

Messlösung minimieren - Injektion maximieren

Ohne die klassische Methode völlig neu gestalten zu müssen, steckt in der Minimierung des Messlösungsvolumens mit Abstand am meisten Einsparungspotential. Die üblichen 1...2 ml Messlösung sind präzise mit geeichten Messkölbchen einstellbar, bequem beim Überführen in die Autosampler-Fläschchen (AS-Vials) und dort mehr als ausreichend für intensive Spülvorgänge im Autosampler. Bei strikter Optimierung der automatisierten Probengebermanipulation (tiefste Spritzennadel-Position, etc.) und Verwendung von speziellen AS-Vials für kleine Volumina kann das Messlösungsvolumen problemlos auf z.B. 100 µl reduziert werden. Das ergibt eine Einsparung von zumindest einer Zehnerpotenz bei jeder einzelnen Dosierposition entlang des Methodenpfades.

Um die Messlösung noch effektiver auszunutzen, folgt als logische Konsequenz die Maximierung des Injektionsvolumens. In der GC ist es ohne großen Aufwand möglich, die klassischen 1...2 µl Injektionsvolumen wesentlich zu steigern, ohne auf Robustheit und Praktikabilität verzichten zu müssen. Dasselbe gilt für die HPLC. Auf die Optimierungsmöglichkeit für die Probenaufgabe bei beiden Techniken wird in der nächsten LABO-Ausgabe ausführlich eingegangen.

Möglichst den Großteil des schon reduzierten Messlösungsvolumens auf die Säule zu bringen, sollte zumindest der erste Schritt sein, zumal keine praktischen Nachteile damit verbunden sind. Denn Präzisionsverluste beim Handling mit den kleinen Volumen werden, im Gegensatz zur klassischen Ausgangsmethode, durch die interne Standardauswertung automatisch ausgeglichen.

Als weitere Maßnahmen zur Adaptierung klassischer Methoden bleiben nur noch konsequente Kürzungen bis zur Eliminierung von Aliquotierungen. In bestimmten Fällen ist es damit u.U. möglich, noch einmal eine Zehnerpotenz einzusparen. Natürlich ist das mit Einschränkungen bei der Flexibilität verbunden. So können eventuell keine Paralleluntersuchungen aus einem bestimmten Extrakt mehr gemacht werden oder Wiederholungen sind nur mehr aus dem Rohextrakt möglich. Diese Vor- und Nachteile gilt es letztlich abzuwägen.

SIVA-Neuentwicklung

Bei der Neuentwicklung einer Stabilisotopenverdünnungs-Methode müssen diese speziellen Anforderungen von Beginn an eingeplant werden. Wenn gleich bei der Konzeption auf kleine Messlösungs- und große Injektionsvolumen geachtet wird, und die notwendige Probenaliquotierung sofort und ausschließlich beim Rohextrakt stattfindet, wird nicht nur beim kostbaren isotopenmarkierten Standard enorm gespart, sondern auch weniger teures Lösungsmittel etc. verbraucht.

Bei einem solchen neuen "Methoden-Design" kostet die Zugabe des internen Standards zu einem 1/10-Aliquot des Rohextraktes bei unserem Beispiel nur mehr ca. 0,2 €. Und damit wird optimale Qualitätssicherung leistbar.

Abgesehen von der Extraktion, die ohnehin so nicht kontrolliert werden kann, ist nur die erste Aliquotierung nicht ständig überprüft (bei Entnahme eines Zehntels des Rohextraktes besteht keine realistische Fehlergefahr). Alle weiteren, wirklich kritischen Schritte wie Clean up, Derivatisierung und GC-Injektion sind mit gelabelten internen Standards bestens abgesichert. Voraussetzung ist in diesem Beispiel allerdings eine weiterentwickelte Derivatisierung, bei der das Silylierungsmittel gleichzeitig auch als Lösungsmittel für die Messlösung fungiert. Als GC/MS-Beispiel kann eine SIVA-Routinemethode für hochtoxische Mykotoxine (A-Trichothecene) dienen [4].

Für die Derivatisierung der A-Trichothecene wird MSTFA (N-methyl-N-trimethylsilyl-trifluoroacetamid mit 1 % Trimethylchlorosilan) verwendet. Mit einem Siedepunkt von 131 °C gilt es als das flüchtigste Silylierungsreagenz und kann nicht zuletzt deshalb gleichzeitig die Funktion des Lösungsmittels übernehmen. Im Gegensatz zu vielen anderen Silylierungsmitteln ist folglich eine aufwendige Zerstörung des MSTFA-Überschusses mit Wasser und die umständliche Reextraktion in ein organisches Lösungsmittel nicht mehr notwendig. MSTFA ist für die Zielanalyten ein gutes Lösungsmittel und der hohe Kondensationspunkt ermöglicht auch Solvent-Effekte und Cold Trapping in der GC-Säule auf hohem Temperaturprogramm-Niveau und damit Voraussetzung für kurze GC-Zykluszeiten. Kleine Reagenzvolumen (50...100 µl) und Injektionsvolumen von zumindest 5 µl steigern die Nachweisempfindlichkeit und reduzieren die Kosten des Silylierungsmittels und der isotopenmarkierten Standards. Der permanent präsente und hohe Reagenzüberschuss verhindert den Zerfall der TMS-Derivate bei der Lagerung und beim Thermo-Stress der Injektion.

Was versteht die EU unter "Identifizierungspunkte"?

Eine hochentwickelte Quantifizierung in Form der beschriebenen SIVA erfordert als Fundament auch eine zweifelsfreie Identifizierung und deren Dokumentation. Nicht zuletzt um ein gewisses Maß an Gleichartigkeit der Messung zu gewährleisten, empfiehlt es sich, die gelabelten Analyten den gleichen Kriterien zu unterwerfen, wie die nachzuweisenden Zielsubstanzen. So können vom Verhalten der internen Standards wichtige Rückschlüsse auf das zu erwartende Verhalten der Zielanalyten abgeleitet werden. Als Beispiele können hier abweichendes Retentionsverhalten und eventuelle Störungen der Signalverhältnisse zwischen Target und Quantifiern genannt werden (siehe unten).

Im Zusammenhang mit den für SIVA-Methoden erforderlichen MS-Verfahren müssen hinsichtlich der Identifizierungserfordernisse die einschlägigen Regulatorien beachtet werden. Als Beispiel soll nur eine EU-Regelung herausgegriffen werden. Die Entscheidung 2002/657/EC der EU-Kommission hat ein Bewertungssystem speziell für massenspektrometrische Messmethoden vorgegeben. Es gilt zwar nur verbindlich für Rückstände von sog. lebensmittelliefernden Tieren, sollte/könnte aber Leitfunktion für vergleichbare rückstandsanalytische Aufgabenstellungen haben.

Es sollen hier nur einige wesentliche Punkte der o.g. Entscheidung angeführt werden, die sich auf Schadstoffe mit Höchstwertregelung (MRL "Maximum Residue Limits"; entspricht den sog. Gruppe B-Substanzen) beziehen und die Massenspektrometrie betreffen.

Neben einer Reihe allgemeiner Richtlinien wurde durch die Einführung des speziellen Identifizierungspunkte-Systems die Möglichkeit eröffnet, Techniken wie die Massenspektrometrie in der GC, aber besonders in der HPLC, aufgrund ihrer jeweiligen Selektivitäten besser zu bewerten. Daher geht das Potential an Identifizierungssicherheit der MS-Verfahren in Form von sog. "Identifizierungspunkten" (IP) in die Bewertung ein. Bei der niedrig auflösenden MS (LR-MS) erzielt ein gemessenes Ion (z.B. im Selected Ion Monitoring-Modus SIM) einen Identifizierungspunkt (IP). Ein SIM-Ion zählt in der hochauflösenden MS (HR-MS) jedoch doppelt.

In der Tandem-Massenspektrometrie (MS-MS) schlägt ein Vorläufer-Ion (Precursor Ion, PC) mit einem IP zu Buche (HR-MS: 2 IP). Jedes daraus resultierende Übergangsprodukt (Product Ion) ist 1,5 Punkte wert (HR-MS: 2,5 IP). Schließlich führen Kombinationen davon (Selected Reaction Monitoring, SRM, bzw. Multiple Reaction Monitoring, MRM) zu Gesamtbewertungen, wie sie in Tab. 1 gegenübergestellt sind. Die drei am Anfang angeführten Beispiele sind die am häufigsten angewandten Varianten. Selbstverständlich sind auch Techniken mit LC/MS (Single Quadrupol bzw. Ion Trap) im Einsatz, deren Anzahl an registrierten Ionen (SIM) die Summe der IPs definieren. Ebenso gelten die angeführten LC/MS-MS-Beispiele auch für die GC/MS-MS, welche für flüchtige Analyten immer mehr Verbreitung finden. Die prinzipiell mögliche Kombination von zwei GC/MS-Verfahren mit Electron Impact (EI) und chemischer Ionisation (CI) ist in der Praxis ebenso selten anzutreffe, wie die parallele Analyse mit GC/MS und LC/MS (Tab. 1 unten).

Als SIM-Ionen sind vorzugsweise Molekülionen bzw. diagnostische Ionen zu verwenden. Das sind z.B. charakteristische Addukte bzw. Fragmente des Molekülions und deren Isotopenionen. Ein klassisches Beispiel sind die charakteristischen Isotopenmuster von Chlor- bzw. Brom-haltigen Verbindungen. Die gewählten Signale sollten allerdings nicht ausschließlich aus demselben Fragment des Moleküls stammen. Das Signal-Rausch-Verhältnis muss zusätzlich mindestens 3 betragen, sonst darf das Ion nicht gewertet werden.

Maßgeblich ist jedoch nicht nur das Vorhandensein der SIM-Ionen bzw. der SRM/MRM-Übergänge, sondern auch deren Intensitätsverhältnisse zueinander. Sie werden mit Kalibrierstandards bestimmt und müssen für eine positive Identifizierung innerhalb definierter Toleranzen liegen. Die erlaubten Abweichungen sind von der relativen Ionenintensität zum Basispeak (100 %) abhängig und in Tab. 2 nach Verfahren differenziert dargestellt.

Für die entsprechende Dokumentation und eine effiziente Beurteilung der Signalverhältnisse empfiehlt sich eine graphische Darstellung (Berechnung über die Peakhöhen), wie in Bild 3 gezeigt. Alternativ dazu, bzw. am besten zusätzlich, ist auch ein rein numerischer Beleg für die Einhaltung der Grenzen für die Dokumentation zweckmäßig. D.h. die Signalverhältnisse werden wie erläutert mit Kalibrierstandards definiert und in Abhängigkeit von den Signalintensitäten mit den Toleranzen aus Tab. 2 versehen (--> Soll- und Toleranzbereich). Die Signalverhältnisse der geprüften Proben müssen dann nur noch damit verglichen werden (--> Kriterien erfüllt/nicht erfüllt).

Selbst bei einem erfüllten Kriterium empfiehlt sich darüber hinaus zur besseren Beurteilung die Angabe der relativen Abweichung vom kalibrierten Signalverhältnis in "+/- %" beim Reporting. So ist auf einen Blick ersichtlich, ob die Übereinstimmung sehr gut (praktisch keine Abweichung) ist, oder aber man sich in der Nähe der Toleranzgrenze befindet.

Gleiches gilt für die rein chromatographische Identifizierung des Peaks über die Retentionszeitfenster. Bei der GC gilt eine Toleranzbreite von +/- 0,5 % und für die HPLC sind +/- 2,5 % vorgesehen (bei relativer Retentionszeitbestimmung). Auch hier sollte das Reporting des Datensystems die Retentionszeiten von Substanzen in der Probe relativ zu den Kalibrierstandards anschaulich darstellen können (Abweichung der tatsächlichen von der erwarteten Retentionszeit).

Vorbildlich sind hier Software-Produkte zur Datenauswertung, die bei der Überprüfung der Identifizierungskriterien (Retentionszeit und alle Signalverhältnisse) die Resultate übersichtlich nach dem Ampel-System darstellen können. Grün markiert sind jene, welche alle Kriterien innerhalb der vordefinierten Grenzen einhalten. Bei Gelb gibt es partielle "Grenzgänger", die einer genaueren Begutachtung bedürfen und Rot markiert nicht-identifizierte Analyten (z.B. mehrere Kriterien nicht erfüllt).

Die EU-Regelung sieht für den o.g. Geltungsbereich vor, dass sog. verbotene Substanzen vier Identifizierungspunkte benötigen und mit MS-Techniken analysiert werden müssen, während für Schadstoffe mit einer Höchstwertregelung (MRL-Substanzen) drei IPs zur Absicherung ausreichen.

Ein Analyt gilt auch dann als identifiziert, wenn im sog. Full-Scan alle diagnostischen Ionen (Molekülion, Addukte, Fragmente, Isotopen, etc.) mit einer relativen Intensität von über 10 % (im Vergleich zum Basispeak) vorhanden sind.

Fazit

Die Adaptierung ("Tuning") von klassischen Methodenstrukturen zur Verwendung von isotopenmarkierten internen Standards ist bezüglich der Zusatzkosten nur vertretbar, wenn das notwendige MS-Equipment bereits zur Verfügung steht. Im ersten Schritt muss das Messlösungsvolumen minimiert und das Injektionsvolumen maximiert werden. Zudem sind Aliquotierungen zu minimieren und an den Beginn des Analysenablaufs zu stellen.

Nur bei Neugestaltung einer SIVA-Methode können diese kostensparenden Grundsätze konsequenter umgesetzt werden. Unter Berücksichtigung der einschlägigen Identifizierungsrichtlinien sind Stabilisotopenverdünnungs-Methoden der Goldstandard bei der massenspektrometrischen Quantifizierung.

Literatur

  • [1] W. Brodacz, "LC/MS-MS-Quantifizierung von Mykotoxinen - Online-SIVA direkt im Autosampler"; LABO 05/12; S 22 - 25 ; Mai 2012.
  • [2] W. Brodacz, "Matrixeffekte in der LC/MS- Strategien zu ihrer Beherrschung - Teil-2: Kompensation"; LABO 04/12 ; S 40 - 43 ; April 2012.
  • [3] W. Brodacz, "Kostenreduktion in der Stabilisotopenverdünnungsanalytik - Qualität verbessern und trotzdem sparen (Teil 1)"; Chemiereport.at 4/2011; S 54-55 ; Juni 2011.
  • [4] W. Brodacz, "Hochtoxische Mykotoxine genau quantifizieren", LaborPraxis LP 10, S 72 - 769; Oktober 2008.
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