Antibiotika und Lebensmittelinhaltsstoffe in Bakterien

Xenobiotischer Stress am Kaffeetisch

Bei der Identifizierung gesundheitsfördernder Effekte von Lebensmittelinhaltsstoffen, aber auch bei der Entwicklung neuer Antibiotika ist wichtig zu wissen, in welcher Konzentration organismenfremde Substanzen im Zellinnern vorliegen. Die Autoren beschreiben eine UHPLC-MS-Methode zur Bestimmung der zeitabhängigen, intrazellulären Konzentration von Antibiotika und Lebensmittelinhaltsstoffen in Bakterien.

Von vielen pflanzlichen Lebensmitteln werden deren Naturstoffe bzw. Sekundärmetabolite von den Bakterien der Darmflora aufgenommen und verstoffwechselt. © Shutterstock/FabrikaSimf
Bakterien sind in ihrer Umwelt einer Vielzahl unterschiedlichster chemischer Verbindungen natürlichen oder synthetischen Ursprungs ausgesetzt. Auf der Suche nach Nahrung nehmen sie viele dieser Verbindungen auf – mit positiven oder negativen Folgen für die bakteriellen Zellen. Zur Aufnahme dieser den Bakterienorganismen fremden Verbindungen (= Xenobiotika) besitzen Bakterien in ihrer Zellwand eine Reihe von Membrankanälen, auch als Porine bezeichnet. Unterschiedliche Porine zeigen eine Selektivität für unterschiedliche Xenobiotika. Hat eine chemische Verbindung es geschafft, durch Porine das Innere der Bakterienzelle zu erreichen, kann die Verbindung unverändert oder verstoffwechselt und als Metabolit wieder ausgeschieden werden. Hierbei nutzt die Zelle sogenannte Effluxpumpen, die ungewollte, meist für sie schädliche Xenobiotika aus der Zelle herausbefördert.

Für eine quantitative Beschreibung dieses Vorgangs – die Bestimmung intrazellulärer Xenobiotika-Konzentrationen in einer Bakterienzelle und deren zeitlicher Verlauf – lagen bis vor kurzem nur sehr spärlich Daten aus vereinzelten Radioassays und Fluoreszenzmessungen vor. Eine generelle analytische Methode zur Bestimmung der Xenobiotika-Konzentrationen fehlte. Dabei ist das Wissen über die Konzentration vor allem in zwei Bereichen wichtig: der Entwicklung neuer Antibiotika und der Identifizierung gesundheitsförderlicher Effekte von Lebensmittelinhaltsstoffen.

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Konzentrationsbestimmung intrazellulärer Antibiotika 

In den letzten Jahren haben mehr und mehr pathogene Bakterien Resistenzen gegen klinisch verwendete Antibiotika entwickelt; die Entwicklung neuer Antibiotika hat daher eine sehr hohe Priorität. Dies ist umso dringlicher als viele globale Pharmaunternehmen ihre Forschungsaktivitäten im Bereich der Infektionskrankheiten in den letzten Jahren aufgegeben haben. Viele Resistenzen entstehen durch Veränderung der Aufnahme, z. B. durch Herunterregulieren von Porinen oder durch Heraufregulieren der Effluxsysteme [1]. Um diese Regulierungen zu verstehen, ist die Konzentrationsbestimmung intrazellulärer Antibiotika notwendig. Weiterhin wurde bei der Entwicklung neuer Antibiotika beobachtet, dass trotz großer Erfolge in High-Throughput-Screenings die gefundenen Leitverbindungen keine antibakterielle Wirkung zeigten, da sie entweder nicht aufgenommen wurden oder direkt wieder ausgeschleust wurden [2]. Daher ist eine generelle Methode zur Quantifizierung intrazellulärer Antibiotikakonzentrationen ein wichtiger Baustein zur Entwicklung neuer wirksamer Antibiotika.

Pflanzliche Lebensmittel und ihre Metabolite

Zahllose epidemiologische Untersuchungen und klinische Interventionsstudien belegen, dass pflanzliche Lebensmittel einen positiven Effekt auf die menschliche Gesundheit haben. Die verursachenden Verbindungen und Wirkmechanismen werden jedoch kontrovers diskutiert [3]. Jedes Lebensmittel mitsamt seiner Inhaltsstoffe kommt im menschlichen Darm in Kontakt mit der Darmflora, einem Ensemble von im Schnitt 1011 Bakterien pro Gramm Stuhl. Von vielen pflanzlichen Lebensmitteln werden deren Naturstoffe bzw. Sekundärmetabolite von den Bakterien der Darmflora aufgenommen und verstoffwechselt. Die so entstandenen Metabolite werden von den Bakterien ausgeschieden und in den menschlichen Körper absorbiert. In vielen Fällen muss man davon ausgehen, dass nicht die eigentlichen Naturstoffe, sondern diese Metabolite für die positiven Gesundheitseffekte verantwortlich sind. 

Weiterhin existiert die Hypothese, dass viele pflanzliche Naturstoffe antibiotisch wirken und somit die Zusammensetzung der Darmflora maßgeblich beeinflussen – mit unbekannten Auswirkungen auf die menschliche Gesundheit [4]. Unbekannt ist, welche Bakterien welche Verbindungen aufnehmen und wie schnell welche Metabolite hierbei entstehen. Eine Methode zur Quantifizierung der Aufnahmekinetik pflanzlicher Xenobiotika kann dazu beitragen diese Vorgänge zu verstehen.

Methodik 

Zur Quantifizierung von Antibiotika und Lebensmittelinhaltsstoffen setzen wir die UHPLC-gekoppelte ESI-Massenspektrometrie (MS) ein, in unserem Falle mit einem Q-TOF-Massenspektrometer. MS erlaubt die Entwicklung einer allgemeinen Methode, die sämtliche ionisierbaren Verbindungen quantifizieren kann. An die Empfindlichkeit des Instruments werden keine hohen Anforderungen gestellt, da relevante Xenobiotikakonzentrationen, für die wir uns interessieren, im mM- bis µM-Bereich liegen und die bakteriellen Konzentrationen im höheren nM-Bereich. Um die notwendige Selektivität sicherzustellen, benutzten wir bei der Quantifizierung Extracted Ion Chromatograms (EICs) mit hochaufgelöster Masse mit einer Massentoleranz von +/- 0,002 Da. Alle analytischen Parameter zur Reproduzierbarkeit und Genauigkeit liegen im erwarteten Bereich [5].

Wichtig ist die Probenvorbereitung und Aufarbeitung: Bakterienkulturen werden bis zu einer gewünschten Zelldichte angezogen, bestimmt durch optische Dichtemessung oder Koloniencount, und mit Antibiotika oder Lebensmittelinhaltsstoffen in biologisch relevanter Konzentration versetzt. Die Experimente können unter aeroben oder anaeroben Bedingungen durchgeführt werden. Proben werden danach zeitabhängig entnommen. Bei der Aufarbeitung werden die Zellen zentrifugiert und mehrmals gewaschen, wobei sicherzustellen ist, dass die Zellen intakt bleiben. Nach Aufschluss der Zellen werden die intrazellulären Xenobiotika mit organischem Lösungsmittel extrahiert, mit SPE aufgereinigt und per UHPLC quantifiziert. Ein weiterer wichtiger Punkt hierbei ist, echte intrazelluläre Xenobiotikakonzentrationen von Konzentrationen zu unterscheiden, die durch nicht-kovalente Bindung oder Absorption auf der Bakterienzelloberfläche entstehen. (Hierzu führten wir ausgedehnte Kontrollexperimente durch, in denen wir kurze Inkubationszeiten, niedere Inkubationstemperaturen und eine Reihe von Inhibitoren des Zelltransportes einsetzten.)

Unter Annahme des durchschnittlichen Zellvolumens der eingesetzten Bakterienzelle und bekannter Zellzahl lässt sich aus den UHPLC-MS-Quantifizierungsdaten die Anzahl der Xenobiotika pro Zelle und damit die intrazelluläre Konzentration zeitabhängig errechnen.

Unsere quantitativen Ergebnisse wurden für die Antibiotikaaufnahme im Rahmen des Innovative Medicine Initiative (imi) der EU Good Drugs for Bad Bugs durch Synchrotonfluoreszenz-Messungen validiert. Beide Methoden stimmen in einem Bereich von +/- 30 % überein [6].

Ergebnis: Drei Arten von Aufnahmekurven

Bild 1: Drei Typen experimentell bestimmter Aufnahmekurven. © Jacobs University Bremen / N. Kuhnert

Wir erhielten Daten für eine Serie von zehn verschiedenen Antibiotika (bisher nicht publiziert) sowie Daten zu Lebensmittelinhaltsstoffen, Quercetinderivaten (aus Zwiebel und Apfel) [5] und Tee und Kaffeephenolen [7]. Als Bakterien setzten wir sowohl ausgewählte Pathogene sowie typische Darmbakterien wie E. coli, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholera, Bifidobacterium und Lactobacillus ein.

Generell beobachteten wir – abhängig von der Struktur des Xenobiotikums und des verwendeten Bakterienstamms – drei grundsätzlich verschiedene Aufnahmekurven (Bild 1). Kurve A steigt stetig an und zeigt eine kontinuierliche Aufnahme des Xenobiotikums durch das Bakterium. Dieses konnten wir allgemein für Phenole und Bifidobacterium beobachten. Dieses Bakterium „reinigt“ also den Darm von Polyphenolen. Kurve B zeigt einen exponentiellen Anstieg, der in ein Plateau mündet. Hier nehmen wir an, dass bei Erreichen des Plateaus sich Aufnahme- und Effluxgeschwindigkeit angleichen. Kurve C verläuft durch ein Maximum. Hier gehen wir davon aus, dass Aufnahme- und Effluxgeschwindigkeit sich angleichen und zusätzlich metabolische Prozesse die Xenobiotikakonzentration herabsetzen. Ausgewählte Metabolite konnten nachgewiesen und quantifiziert werden.

Für Antibiotikaaufnahmekurven konnten wir zeigen, dass ein Plateau wie in Kurve B innerhalb von 30 Minuten erreicht wird und die intrazelluläre Konzentration der Antibiotika im Bereich der Inhibierungskonstanten liegt oder diese übersteigt. (Die Methode wird hoffentlich bei der Entwicklung neuer Antibiotika von Nutzen sein.)

Bild 2: Aufnahmekurven für ausgewählte Kaffeephenole aufgenommen durch E.coli [7] © Jacobs University Bremen / N. Kuhnert

Für Lebensmittelinhaltsstoffe konnten wir zeigen, dass diese im Zeitfenster eines Darmaufenthaltes von Darmbakterien aufgenommen werden. Experimente wurden mit Reinsubstanzen, definierten Gemischen von bis zu vier Verbindungen und echten Lebensmitteln durchgeführt. Die experimentelle Aufnahmekinetik und Endkonzentrationen sind stark strukturabhängig. Folglich muss eine aktive Aufnahme erfolgen, zumal es keine Korrelation zwischen der Aufnahmekinetik und der Polarität der Verbindungen gab und die intrazelluläre Konzentration häufig die Konzentration im Nährmedium überstieg. Die meisten der Kurven zeigen dazu Muster C. Für Quercetinderivate konnten wir Metabolite identifizieren, die intrazellulär akkumulieren.

Man kann diese Kurven als Äquivalent zu Bioverfügbarkeitskurven in der Pharmakologie betrachten, und somit bakterielle Tmax und Cmax Werte definieren. Bild 2 zeigt einige ausgewählte experimentelle Daten zur Aufnahme von Kaffeephenolen, sogenannten Chlorogensäuren in E. coli. Sie zeigen klar die Abhängigkeit von Tmax und Cmax von der chemischen Struktur der Kaffeenaturstoffe. Weiterhin liefern unsere Daten als Abfallprodukt einen Einblick in den bakteriellen Gesamtmetabolismus, der unter xenobiotischen Stress gestellt wird. 

AUTOREN

Nikolai Kuhnert
Inamullah Said
Rohan Shah

Jacobs University Bremen
Department of Life Sciences and Chemistry

Literatur

  1. M. Pagès, C. E. James, M. Winterhalter, The porin and the permeating antibiotic: A selective diffusion barrier in Gram-negative bacteria. Nature Reviews Microbiology 6, 893-903 (2008).
  2. J. Payne, M. N. Gwynn, D. J. Holmes, D. L. Pompliano, Drugs for bad bugs: confronting the challenges of antibacterial discovery. Nature Reviews Drug Discovery 6, 29-40 (2007).
  3. Crozier, I. B. Jaganath, M. N. Clifford, Dietary phenolics: chemistry, bioavailability and effects on health. Natural Product Reports 26, 1001-1043 (2009).
  4. Williamson, M. N. Clifford, Role of the small intestine, colon and microbiota in determining the metabolic fate of polyphenols. Biochemical Pharmacology 139, 24-39 (2017).
  5. H. Said, R. L. Shah, M. S. Ullrich, N. Kuhnert, Quantification of microbial uptake of quercetin and its derivatives using an UHPLC-ESI-QTOF mass spectrometry assay. Food & Function 7, 4082-4091 (2016).
  6. Vergalli et al., Spectrofluorimetric quantification of antibiotic drug concentration in bacterial cells for the characterization of translocation across bacterial membranes. Nature Protocols 13, 1348-1361 (2018).
  7. Hakeem Said, S. Gencer, M. S. Ullrich, N. Kuhnert, Tea and coffee time with bacteria – Investigation of uptake of key coffee and tea phenolics by wild type E. coli. Food Research International 108, 584-594 (2018).
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