Fachbeitrag

AF4 gekoppelt mit MALS

Ein neues analytisches Verfahren zur ­Optimierung von High-Throughput ­Protein Refolding Experimenten
Christoph Johann, Wyatt Technology Europe, Paul Ramage & René Hemmig, Protein Structure Unit, Central Technologies, Novartis Pharma AG
Mit dem Abschluss des Human Genome Projektes wurden etwa 100000 Proteine identifiziert, von denen eine größere Anzahl viel versprechende potentielle Drug-Targets darstellen. Damit entsprechende Wirkstoffe entwickelt werden können, werden ausreichende Mengen jedes Proteins in guter Reinheit und mit voller biologischer Funk­tionsfähigkeit benötigt. Es müssen biologische Assays ausgearbeitet, Strukturuntersuchungen durchgeführt und die biologische Funktion zweifelsfrei ermittelt werden. Es sind aber weniger als 500 dieser potentiellen Target-Proteine kommerziell erhältlich, und damit wird es zu einer Herausforderung diese Proteine in ausreichender Menge schnell und kosteneffektiv zu beschaffen.

Rekombinante Proteine für diese Anwendungen müssen in der nativen und aktiven Konformation vorliegen, d.h. korrekt gefaltet sein. Da die biologische Funktion der Proteine im Allgemeinen unbekannt ist, kann der korrekte Faltungszustand nicht mit einem biologischen Assay getestet werden. Es wäre auch unabhängig davon ein zu großer Aufwand für jedes Protein einen passenden Assay zu entwickeln.

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Alternative Methoden, die bisher angewendet wurden, wie Reversed Phase High Performance Liquid Chromatography (RP-HPLC), Größenausschluss-Chromatographie (SEC oder GPC) und Fluorometrie haben schwerwiegende Limitationen. In diesem Artikel wird die neue Methode asymmetrische Fluss-Feld-Fluss-Fraktionierung (AF4) gekoppelt mit Multi-Angle-Lichtstreuung (MALS) vorgestellt, die bei der Novartis Pharma AG in Basel seit einigen Jahren erfolgreich eingesetzt wird.

High-Throughput Protein Refolding

Escherichia coli (E. coli) ist das bevorzugte Expressionssystem weil es in Bezug auf Homogenität, Produktivität, Geschwindigkeit und Möglichkeiten der Markierung der Proteine Vorteile bietet. Der Nachteil liegt darin, dass ein erheblicher Anteil der Proteine (40...60 %) in Inclusion Bodies (IB) anfällt und damit in unlöslicher und denaturierter Form vorliegt. Es ist zwar einfach, diese IB‘s zu reiningen und zu lösen, damit sind die Proteine im Allgemeinen aber noch nicht in die native und aktive Form überführt. Dies muss in einem besonderen Verfahren erfolgen, dass als Protein Refolding bezeichnet wird.

Refolding ist der Prozess, mit dem das Protein von der denaturierten Form in die native, gefaltete Konformation gebracht wird. Um dies zu erreichen, werden die IB‘s zunächst unter Zusatz von Detergentien, Chaotrophien oder Harnstoff gelöst. Diese Lösungen können Verunreinigungen enthalten, die sich bei der späteren Renaturierung als störend erweisen.

Die hohe Konzentration der denaturierenden Zusatzstoffe bewirkt, dass sich das Protein im ungeordneten und ungefalteten Zustand befindet, es liegt als aufgeweitetes Knäuel in Lösung vor. Die Aufgabe besteht darin, die Konzentration der denaturierenden Substanzen zu verringern und das Protein auf eine geeignete Weise in native Lösungsbedingungen zu bringen, die dazu führen, dass die richtige, native Konformation erreicht wird. Die besten Bedingungen lassen sich nur experimentell im Trial and Error-Verfahren finden. In einer Versuchsserie wird eine Liste von Zusätzen und Bedingungen ausprobiert, sogenannte Hits selektiert und weiter optimiert. Um den Zeitaufwand zu verringern, entspricht es dem Stand der Technik, sogenannte High-Throughput-Verfahren anzuwenden, d.h. die Versuche werden in Wellplates mit 96 oder 386 Vertiefungen parallel gefahren.

Refolding Read-Out Methoden

Bei der Definition der Versuchsmatrix wird eine Reihe von Parametern ausgewählt, die systematisch variiert werden, beispielsweise Puffer-Zusätze, pH, oder synthetische Chaperone. Zur Auswertung des Versuchs muss dann der Erfolg bewertet werden, indem die Menge des korrekt gefalteten Proteins bestimmt und über die ganze Serie verglichen wird. Das Problem besteht darin, eine optisch klare Lösung mit nativem, korrekt gefalteten Protein zu unterscheiden von einer optisch ebenso klaren Lösung, die aber aggregiertes, bzw. denaturiertes, biologisch nicht aktives Protein enthält.

RP-HPLC und Trübungsmessungen können diese Unterscheidung nicht treffen, Circular Dichroismus-Spektroskopie (CD) ist nicht empfindlich genug und geht nicht schnell genug. Fluorometrische Messungen sind grundsätzlich geeignet, benötigen aber relativ hohe Proteinkonzentrationen, die nicht kompatibel mit dem 96-Wellplate-Format sind. Außerdem hängt die Empfindlichkeit stark von der Aminosäurenzusammensetzung ab (Tyrosin und Tryptophan-Gehalt), sowie von Quenching-Effekten, die von manchen Zusätzen verursacht werden. Deshalb ist diese Methode nur beschränkt einsetzbar. In günstigem Fällen ist Fluorometrie gut geeignet und erlaubt es auch, verschiedene Proben zu vergleichen.

Der hohe Anteil an hochmolekularen Proteinaggregaten macht eine Analyse mittels Größenausschlusschromatographie (SEC) nicht praktikabel, die Säulen werden schnell verstopft. Manche Zusätze sind aggressiv und zerstören das Säulenpackmaterial. Verstopfung der Säule führt zu Druckanstieg, Probleme mit der Reproduzierbarkeit und erniedrigt die Lebensdauer der Säule dramatisch.

Die Lösung

Worin liegt nun die Lösung? Novartis setzt seit einigen Jahren ein Eclipse® Fluss-Feldfluss-Fraktionierungssystem ein, gekoppelt mit einem miniDAWN Lichtstreudetektor (beides von Wyatt Technology), sowie Agilent 1100 HPLC Pumpe, Degasser, UV Detektor und Autosampler. Die Eclipse arbeitet auf der Grundlage der Feld-Fluss-Fraktionierung, aber die Bedienung unterscheidet sich nicht wesentlich von einer HPLC- oder SEC-Anlage.

Feld-Fluss-Fraktionierung (FFF)

Makromolekulare Charakterisierung durch FFF ist eine nichtdestruktive. Ein-Phasen-Trennung, mit deren Hilfe Molmassen und -Größen in Lösung bestimmt werden können. Wie in der klassischen Chromatographie werden die Probenbestandteile entsprechend bestimmter physiko-chemischen Eigenschaften getrennt und eluieren daher zu bestimmten Retentionszeiten. Im Falle der FFF ist der entscheidende Parameter der Stokes-Radius der Moleküle bzw. Partikel. Im Gegensatz zur Säulenchromatographie erfolgt die Trennung aber nicht durch Wechselwirkung mit einer stationären Phase.

Die Trennung wird demgegenüber erreicht durch Platzierung von Probenbestandteilen in verschieden schnellen Strömungsschichten in einer laminaren Strömung eines Kanals. Dieser besteht aus 2 Platten, zwischen denen eine Spacerfolie liegt, in die der Kanal als trapezförmiger Ausschnitt eingebracht wurde. Die Platten werden mit der Spacerfolie dazwischen verschraubt. Die obere Platte besteht aus Glass oder Kunststoff, während die untere Platte eine Fritte enthält. Eine auf der Fritte liegende Ultrafiltrationsmembran verhindert, dass die Probe aus dem Kanal gespült werden kann. Der in den Kanal eintretende Flüssigkeitsstrom wird aufgeteilt in den Cross-Flow, der durch die Fritte nach unten austritt und den Kanalfluss, der längs des Kanals zum Auslass geht und mit der auftgetrennten Probe durch die Detektoren fließt.

Im ersten Schritt wird die Probe in den Kanal injiziert in der Fokussierungsphase für die Elution vorbereitet. Dazu wird der Fluss gesplittet und von beiden Enden dem Kanal zugeführt, so dass sich die Flüssigkeitsfronten genau unter dem Injektionsport treffen. Hier weist die Strömungsrichtung senkrecht nach unten und die Probe wird in diesem Feld fokussiert, d.h. in einer engen Bande konzentriert. Die Stokes-Reibungskraft führt zu einer Anreicherung der Probe an der Membran, wodurch eine Diffusionskraft entsteht, die dem Cross-Flow entgegengesetzt ist. Im stationären Gleichgewicht heben sich beide Kräfte in einer bestimmten Höhe über der Membran auf. Diese Höhe ist eine Funktion des Diffusionskoeffizienten, kleinere Moleküle werden höher in den Kanal wandern als größere.

Im zweiten Schritt wird ein Ventil geschaltet und der Fluss nun nur vom Kanaleinlass her eingeleitet. Die fokussierte Probenbande wird längs des Kanals transportiert und dies verschieden schnell, denn die Höhe entspricht einer bestimmten Geschwindigkeit in der laminaren Strömung. Je höher, desto schneller der Transport zum Kanalauslass und zum Detektor. Das ist wie bei Booten, die mit verschiedenem Abstand vom Ufer in der Strömung flussabwärts treiben. Je weiter sich ein Boot in der Flussmitte befindet, desto schneller wird es treiben. Grosse Partikel bzw. Moleküle eluieren also später als die kleinen, genau umgekehrt wie in der SEC.

Der Trennprozess ist schnell und schonend, denn es treten nur sehr geringe Scherkräfte auf. Im Verhältnis zu einer stationären Phase ist die Fläche des Kanals extrem klein, und daher die Gefahr von Absorption wesentlich reduziert.

Im Vergleich zur SEC hat die AF4 eine höhere Selektivität und deckt eine größere Bandbreite an Applikationen ab.

Multi-Angle Lichtstreuung (MALS)

Die MALS-Detektoren, die hier verwendet werden, sind die einzigen absoluten Multi-Angle-Lichtstreudetektoren auf dem Markt. Das bedeutet, sie bestimmen die Molmasse direkt aus der gemessenen Streuintensität ohne Bezug auf einen Molmassenstandard. Kalibriert wird etwa einmal im Jahr mit reinem Toluol.

Bei der Bestimmung der Protein Monomermolmasse und Detektion von Aggregaten kommt es entscheidend auf die hohe Empfindlichkeit des Lichtstreudetektors an. Die Proteine liegen in geringer Konzentration vor und nur wenige Mikroliter können für die Messung verwendet werden. Dementsprechend klein sind die Signale der Monomere, die typischerweise Molmassen von einigen zehntausend Dalton haben. Gleichzeitig müssen aber die Aggregate bestimmt werden, die aufgrund ihrer Molmassen von einigen Millionen Dalton auch um Größenordnungen höhere Signale erzeugen, denn die Response des Lichtstreudetektors ist Konzentration mal Molmasse. Das stellt höchste Ansprüche an den Lichtstreudetektor, der über ein enorm gutes Signal/Rauschenverhältnis und einen hohen dynamischen Bereich verfügen muss. Der miniDAWN Detektor erweist sich als dieser Aufgabe gewachsen und mittels der AF4-Trenntechnik gekoppelt mit MALS ist es möglich, in einem Trennungsgang Monomere und Aggregate bezüglich der Molmasse und der Konzentration zu bestimmen. Die einzigartige Konstruktion der Lichtstreuzelle und die hervorragende Konstruktion der optischen Bank erweisen sich als entscheidende Qualitätsmerkmale, die für diese anspruchsvolle Applikation entscheidend sind.

AF4-MALS

AF4-MALS erweist sich als hochauflösendes Verfahren, mit dem renaturierte Monomere charakterisiert und damit Hits in der Refolding Matrix eindeutig identifiziert werden können. Trennungen benötigen weniger als 12 min und liefern sehr reproduzierbare Ergebnisse. Monomer und Aggregate können zuverlässig getrennt und bezüglich Molmasse und Konzentration bestimmt werden und das bei nur 1...2 µg injiziertem Protein. Das System ist vollautomatisiert durch die softwaregesteuerte Integration des Agilent 1100 Autosamplers.

Mittels MALS erhält Novartis genaue Molmassen für die nativen Proteine, typischerweise innerhalb 10 % der theoretischen Werte. Die Auswertung der Monomer Recovery erlaubt ein Ranking innerhalb der Refolding Matrix um das produktivste Protokoll zu ermitteln.

Ergebnisse

Um die Zuverlässigkeit der Methode zu überprüfen, wurden mehrere Proteintrennungen hintereinander ausgeführt um zu überprüfen, dass die Monomer/Dimer Quantifizierung reproduzierbar war. In einer Modellstudie wurde die FFF-MALS Methode mit HPLC verglichen und festgestellt, dass die FFF-Methode die Ausbeute an renaturiertem Protein zuverlässig bestimmen konnte, während die HPLC einen konstanten Proteingehalt ermittelte, also nicht zwischen renaturierten und aggregierten Anteilen unterscheiden konnte.

Zusammenfassung

Das Eclipse AF4 System gekoppelt mit MALS hat sich als zuverlässiges und effektives Verfahren erwiesen, mit dem die optimalen Refolding Bedingungen in einer Matrix identifiziert werden können. Novartis hat eine Reihe von unterschiedlichen Methoden getestet um die Ausbeute an nativen Proteinen zu bestimmen und bezeichnet die Eclipse AF4 als das beste Verfahren. Zusätzlich ist die Eclipse auch geeignet, Proteinlösungen, die zur Strukturbestimmung und für Kristallisationsversuche benötigt werden, zu charakterisieren.

Mittels der AF4-MALS ist es Novartis gelungen, eine Reihe von neuen Proteinen zu renaturieren und die Refolding Matrix zu optimieren. AF4-MALS hat sich als Standardmethode etabliert und die Kapazitäten sollen in der Zukunft weiter ausgebaut werden.

Vielen Dank an René Hemmig und Paul Ramage, beide von der Novartis Pharma AG, die das Material für diesen Artikel zur Verfügung gestellt haben.

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