Interne Standards extern auswerten

Monitoring von Matrixeffekten in der LC-MS

Matrixeffekte sind das Hauptproblem in der LC-MS/MS und können selbst durch deren enorm hohe Selektivität nicht vermieden werden. Daher sollten sie bestmöglich kompensiert und in der Routineanalytik bei jeder Probe überwacht werden.

Durch Probenbestandteile verursachte Veränderungen des Detektorsignals werden als Matrixeffekte bezeichnet. Bei einer externen Kalibrierung mit matrixfreien Lösungen führen sie in der LC-MS durch die matrixbedingte Beeinträchtigung der Ionisierung zu fehlerhaften Quantifizierungen bei Proben. 

Die Kopplung von HPLC und der (Tandem-)Massenspektrometrie hat sich in den letzten Jahren rasant entwickelt, und Selektivität und Sensitivität konnten wesentlich verbessert werden. Aber selbst die höchste Selektivität moderner Massenspektrometer ist machtlos gegen die Matrixeinflüsse. Sie können Störsignale zwar gezielt ausblenden, so dass sie nicht mehr sichtbar sind, der gefürchtete Einfluss der Matrix auf die Quantifizierung bleibt jedoch bestehen. Das Problem durch koeluierende Matrixkomponenten einer Probe entsteht nämlich bereits in der Ionenquelle vor dem hochselektiven Massenanalysator.

Betroffen sind all jene Proben, bei denen simultan in die Ionenquelle eluierende Störstoffe die Ionisierungseffizient herabsetzen (häufig auftretende „Ion Suppression“) oder erhöhen (selteneres „Ion Enhancement“), während für die Kalibrierung praktisch immer matrixfreie Standardlösungen (Standards in reinem Lösungsmittel) herangezogen werden. 

Anzeige
Bild 1: Retentionszeit-Shift durch Isotopeneffekt bei der Deuterierung (d5-Atrazin = schwarz vs Atrazin = grün + gelb) im Gegensatz zur 13CMarkierung ohne Verschiebung (vollständig gelabelte T-2 = rot vs natives T-2 = grün + blau + schwarz); (Darstellung der SIM-Ionen von Target T mit Qualifiern Q1-2 in der GC).

Störung der Ionisation
Als Hauptursache gilt, dass die Störstoffe bei der Ionisation mit den Zielanalyten in Konkurrenz treten und z.B. durch eine Unterdrückung der Ionenbildung zu Unterbefunden führen. Das trifft besonders für die Elektrospray-Ionisation (ESI) zu, bei der ein Wettstreit von Analyten und Matrixbestandteilen um die begrenzt zur Verfügung stehenden Oberflächenladungen angenommen wird. 

Die Probenbestandteile verändern aber auch die Oberflächenspannung der ESI-Tröpfchen und haben damit Einfluss auf die Aufspaltung in noch kleinere Tröpfchen durch die sog. Coulomb-Explosionen. Diese Beeinträchtigungen treten nicht nur bei der weit verbreiteten ESI, sondern auch bei den Ionisationstechniken APCI (Atmospheric Pressure Chemical Ionisation) und etwas seltener bei APPI (Atmospheric Pressure Photo-Ionization; basiert nicht auf Ladungs-Affinität) auf. Während ESI sehr anfällig auf „Ion Suppression“ ist, wird bei APCI öfter über Signalerhöhungen („Ion Enhancement“) geklagt.

Obwohl manche Mykotoxine bei Zerealien mit der APPI (DON, NIV) die geringsten Matrixeffekte zeigen, oder für Einzelanalyten die APCI günstiger sein mag, hat sich die Elektrospray-Ionisation für Multimethoden durchgesetzt. ESI kann nicht nur die allgemein höchste Ionisierungsrate für sich verzeichnen, sie generiert bei praktisch allen Toxinen ein zumindest brauchbares Signal.

Bild 2: ESI-Chromatogramme (Darstellung als summierte MRM-Signale) von 17 Mykotoxinen (blau; Analyten mit internem Standard sind fett gedruckt) mit 13 isotopenmarkierten internen Standards (rot). Die Differenzierung der Substanzen erfolgt über unterschiedliche MRM-Übergänge. Phenomenex C18 Gemini 150 x 4,6 mm 5 μm 1 ml/min (binärer Gradient Wasser/MeOH; Modifier: 5mM Ammoniumacetat; 1 % Essigsäure).

Für alle Ionisationstechniken gilt, dass die unerwünschten Effekte primär von der Matrix abhängig sind, das Ausmaß aber auch zwischen den Analyten stark differieren kann. Oft sind auch nur bestimmte Chromatogrammbereiche stark betroffen – diese entsprechen den primären Elutionsbereichen der Störstoffe.

Für die numerische Angabe der Matrix-effekte ME haben sich zwei Bezeichnungen etabliert, die über den Quotienten der Detektor-Signale von Messungen mit bzw. ohne Matrix berechnet werden.  

  • Matrixeffekt ME% = ((Fläche des gespikten Extraktes/Fläche des reinen LM-Standards) - 1) x 100.
    Sind beide Signale gleich, zeigt ein Ergebnis von 0 % die Abwesenheit von Matrixeffekten an. Suppressions-Effekte ergeben negative ME%-Werte, positive %-Ergebnisse belegen die eher selteneren Enhancement-Phänomene. 
  • „Signal Suppression Enhancement“ SSE% = (Fläche des gespikten Extraktes/Fläche des reinen LM-Standards) x 100.
    Dabei sind 100 % gleichbedeutend mit „kein Matrixeffekt“, Ergebnisse unter 100 zeigen Ionen-Unterdrückung an und Werte über 100 werden durch Enhancement verursacht.
Bild 3: Wiederfindungsraten von vier gelabelten Aflatoxinen (mit jeweils zwei MRM-Übergängen) einer typischen Futtermittel-Routinesequenz. Die verbundenen Punkte kennzeichnen die über die Sequenz verteilten Kalibrierstandards (fünf Konzentrationslevels mit Dreifachinjektionen). Die Einzelpunkte repräsentieren die Matrixeffekte bei Proben in Form der Rückgewinnungen.

Isotopologe
Die Evaluierung und die Bekämpfung der Störeinflüsse sind schon bei der Methodenentwicklung von primärer Bedeutung. Die Strategien gegen die Matrix-bedingten Veränderungen des MS-Response können in Reduktionsmaßnahmen wie (zusätzliche) Vorreinigung (Clean up), verbesserte chromatographische Abtrennung und Verdünnung etc. [1] bzw. Kompensationstechniken wie Standardaddition, Echo-Peak-Technik, strukturverwandte interne Standards bzw. isotopenmarkierte interne Standards [2] eingeteilt werden. Die einfachste Matrix-Reduktion wird durch das Verdünnen der Messlösung erreicht („Dilute and Shoot“), während die effizienteste und eleganteste Kompensations-Variante die sog. Stabilisotopenverdünnungsanalytik (SIVA; engl. Stable Isotope Dilution Analysis SIDA) mit z.B. voll 13C-markierten Analogen der Zielanalyten ist. Eine Kombination beider Möglichkeiten wird vom Autor für die Multimykotoxin-Routineanalytik eingesetzt.

Zur Markierung (d.h. dem Einbau schwererer stabiler Isotope) bieten sich 13C-Atome und die Deuterierung an. Während unter ungünstigen Umständen ein Deuterium/Protonen-Austausch bei z.B. wässrigen Probenextrakten stattfinden kann, ist die 13C-Markierung mit höherem Herstellungsaufwand verbunden, aber bei weitem am sichersten. Bei der Deuterierung wird die Masse des substituierten Elements um 100 %, beim Austausch von 12C durch 13C nur um ca. 8 % erhöht. Die Änderungen führen zu entsprechenden Differenzen bei den Reaktionsgeschwindigkeiten. „C-H“-Bindungen reagieren 6...10 mal schneller als vergleichbare „C-D“-Bindungen. Der Unterschied zwischen 12C und 13C-Bindungen beträgt lediglich 4 %, obwohl in beiden Fällen 1 Dalton Unterschied besteht. Dieses etwas differierende Verhalten von nativen und markierten Analyten wird als Isotopeneffekt bezeichnet und ist in der Chromatographie (GC und LC) durch leicht verschobene Retentionszeiten von deuterierten Substanzen erkennbar. Bei 13C-Markierungen ist der Isotopeneffekt zu schwach, um chromatographisch relevant zu werden. Praktisch macht sich das Phänomen z.B. in der GC-Analytik des Herbizides Atrazin bemerkbar, wo sogar der nur fünffach deuterierte interne Standard d5-Atrazin chromatographisch vom nativen Herbizid abgetrennt wird (Bild 1, links).

Schon 5 Dalton Massenunterschied bei d5-Atrazin führen auf unpolaren GC-Säulen zu einer deutlichen Reduktion der Retentionszeit gegenüber normalem Atrazin. Selbst das um 24 Dalton schwerere, voll 13C-markierte T-2 Toxin (Trichothecen-Mykotoxin) kann mit der hohen Trennleistung von GC-Kapillaren nicht mehr vom nativen Mykotoxin separiert wer-den und eignet sich daher hervorragend als idealer interner Standard (Bild 1, rechts).

Bild 4: Wiederfindungen der isotopenmarkierten Mykotoxine (interne Standards) in 886 Futtermittel-Routineproben. Vergleiche der Standardabweichungen (schwarzer Rahmen), Spannweiten (orange Linie) und Mittelwerte bei üblicher Aufarbeitung (25 mg Ew/ml RE; blaue Balken) bzw. nach zusätzlicher 1 : 5-Verdünnung (gelbe Balken) belegen die Reduktion der Matrixeffekte durch die Verdünnung.

„Dilute and Shoot“ mit „online-SIVA“
Das Konzept der Mykotoxin-Multimethode mittels HPLC-Tandem-Massenspektrometrie (Triple-Quadrupol) beruht auf dem „Dilute and Shoot“-Ansatz, da ein gemeinsames Clean up durch die stark unterschiedlichen Eigenschaften der verschiedenen Mykotoxin-Gruppen nicht mehr möglich ist. Ein sogenannter Rohextrakt, der aus der Extraktion von 25 g Einwaage mit 100 ml Lösungsmittelgemisch (79 % Acetonitril, 20 % Wasser, 1 % Eisessig; 2 h) resultiert, wird im Routinebetrieb vor der Probeninjektion am LC-MS/MS 1 : 10 wässrig verdünnt. 

Die Auswertung von 13 Mykotoxinen erfolgt letztlich durch die klassische interne Standardkalibrierung mittels der dafür optimal geeigneten voll 13C-markierten Mykotoxine (SIVA). Die dafür notwendige gemeinsame Bezugsbasis wird dadurch gewährleistet, dass sowohl bei den Kalibrierstandards als auch bei allen Proben, jeweils dieselbe Menge an internen Standards (IStd) automatisiert zudosiert wird. Diese Aufgabe wird präzise und reproduzierbar von einem programmierbaren Autosampler unmittelbar vor der Probenaufgabe erledigt. Dazu werden in der Probenschleife des Autosamplers 20 µl des verdünnten Rohextraktes bzw. des Kalibierstandards mit 20 µl eines internen Standardgemisches (13 isotopenmarkierte Mykotoxine) vereinigt und gemeinsam injiziert [3].

Die Belastung des Analysensystems beträgt dabei 0,5 mg Matrixanteil, welcher mit dem Probenaliquot direkt auf die HPLC-Säule dosiert wird. Durch die erhebliche Störstofffracht entstehen Matrixeffekte (Suppression oder Enhancement), die aber automatisch durch die interne Kalibrierung kompensiert werden.

Bild 5: Auswirkungen von abgestuften Rohextrakt-Verdünnungen auf das Ausmaß der Matrixeffekte in Form der Wiederfindung von isotopenmarkierten Mykotoxinen (100 % entspricht der Abwesenheit von Matrixeffekten).

Obwohl bei der Methodenvalidierung die wichtigsten Daten zur Beurteilung der Matrixeinflüsse der überprüften Materialien ermittelt werden, fallen bei der anschließenden Routineanalytik schon wegen des enormen Probenumfangs wesentlich umfassendere Informationen an. Auch die Variationsbreite der Matrixzusammensetzungen ist in der Routine wesentlich größer. 

Interne Standards extern auswerten
Die Aufgabenstellung Futtermittelanalytik umfasst ein besonders breites Spektrum an verschiedensten Ausgangsmaterialien und damit eine Vielzahl an Matrixstörstoffen. Bei jeder einzelnen Probe werden dadurch verursachte Unterdrückungen (häufig) bzw. Erhöhungen (seltener) der MS-Signale für jeden Analyten mittels der gelabelten internen Standards automatisch korrigiert. Dabei fallen bei jeder Messung Informationen über die Signalveränderungen an. Um diesen umfangreichen Erfahrungsschatz zu heben, d.h. die individuellen Matrixeffekte sichtbar zu machen, bedarf es nur der gesonderten Definition einer klassischen externen Standardkalibrierung in der Auswertemethode.

Dafür werden die ohnehin aufgezeichneten Peaks der internen Standards zusätzlich wie externe Standards verwendet und liefern so zu jeder einzelnen Probe die jeweils individuellen Wiederfindungsraten bzw. Matrixeffekte der 13 in Bild 2 fett markierten Mykotoxine.

Eine Darstellung dieser Wiederfindungsraten aus einer Probensequenz mit Kalibrierung zeigt eine geringe Schwankung bei den gleichmäßig über den Probenablauf verteilten Kalibrierstandards (zusammenhängende Punkte oben in Bild 3). Die oftmals weit unter dem Soll von 100 % liegenden, nicht verbundenen Punkte der einzelnen Proben machen deutlich, dass im dargestellten Fall die Gruppe der Aflatoxine gravierenden Matrixeffekten unterliegen kann. Der Plot gibt einerseits einen schnellen Überblick hinsichtlich der üblichen Schwankungen bzw. eventuellen zeitlichen Trends bei reinen Standards und zeigt andererseits besonders betroffene Proben mit ausgeprägten Matrixeffekten auf.

Verdünnen reduziert Matrixeffekte
Um diese teilweise großen Unterschiede zwischen den Proben, aber auch unter den Mykotoxinen, aufzuzeigen, wurden alle o.g. Wiederfindungsraten (WFR) über ca. ein Jahr Routineanalytik von Futtermitteln in Bild 4 dargestellt (n = 886 Proben). 

Die blauen Balken zeigen den Mittelwert der Rückgewinnungen jedes gelabelten Toxins der Routineprobe an. Der schwarze Rahmen um den Mittelwert symbolisiert eine Standardabweichung nach oben und unten. Die Spannweite zwischen niedrigster (Suppression) und höchster (Enhancement) Wiederfindung ist orange gekennzeichnet.

Im Mittel ist der dominierende Effekt immer eine Signalunterdrückung, wenn auch im Einzelfall immer wieder Verstärkungen um ca. 50...100 % auftreten können.

Das Ausmaß der Matrixeffekte hängt abgesehen von der Analyt/Matrix-Kombination auch von sehr vielen technischen Faktoren ab (Ionisierungsmethode, Ionenquellen-Design, Flussrate, Lösungsmittelzusammensetzung, Modifiertyp – u. Konzentration, etc.). Trotzdem weisen die angeführten Ergebnisse eine relativ gute Übereinstimmung mit einer umfassenden Studie zu diesem Thema auf [4]. Im Schnitt liegen deren Rückgewinnungen bei Zerealien bei 42...125 %. Nur bei Heu und Silage wurden extreme Suppressionen (7 % SSE meist bei Deoxynivalenol, Nivalenol u. Zearalenon) und Signalerhöhungen (187 % SSE bei den Fumonisinen) beobachtet.

Rund 22 % der o.g. 886 Futtermittel wurden aufgrund von witterungsbedingt sehr hohen Toxin-Belastungen (meist mit Deoxynivalenol DON und Zearalenon ZON) zusätzlich um den Faktor 5 verdünnt und parallel gemessen. Die mit „Verd.“- gekennzeichneten Analyten wurden nur von einem Fünftel der Matrixmenge (0,1 mg Matrixaliquot injiziert) beeinflusst, ihre Rückgewinnungs-Mittelwerte sind gelb dargestellt. Die Matrix-Verdünnung verbessert die Wiederfindungen durch Reduktion der Matrixeffekte um durchschnittlich 11 %, wobei die Aflatoxine mit durchwegs 20 % am meisten profitieren.

Bei den Schwankungsbreiten (schwarze Rahmen) profitieren hingegen alle Analyten enorm von der Verdünnung. Im Durchschnitt reduziert sich bei einem Fünftel der Matrixfracht die Standardabweichung um den Faktor 2,8. (Bild 4).

Optimaler Verdünnungsfaktor
Zur näheren Betrachtung, wie stark sich die Belastung mit störenden Probenbestandteilen auf das Ausmaß der Matrixeffekte der wichtigsten Mykotoxine bei größeren Verdünnungs-Spannweiten auswirkt, wurden aus den o.g. 886 Proben jene neun Mischfuttermittel selektiert, welche durch hohe und/oder vielfältige Matrixeffekte auffallen (meist stark gefärbte Rohextrakte). Zusätzlich zur methodenkonformen Rohextrakt-Verdünnung von 1 : 10 (V10: 0,5 mg Matrix injiziert) wurden die Abstufungen 1 : 2 (V2: 2,5 mg), 1 : 5 (V5: 1 mg), 1 : 25 (V25: 0,2 mg) und 1 : 100 (V100: 0,05 mg) für einen Vergleich der Matrixeffekte ausgewählt.

Im Bild 5 sind die resultierenden Wiederfindungen der gelabelten Toxine gegen die zunehmende injizierte Matrixbelastung (bzw. abnehmendes Verdünnungsverhältnis des Rohextraktes) aufgetragen.

Auffallend ist, dass es sich praktisch immer um Ionen-Unterdrückung handelt, was auch (mit Ausnahme von Fumonisin B1 und wenigen Einzelfällen) durch die Gesamtübersicht in Bild 4 bestätigt wird.

Zwischen der Verdünnung V25 und V100 sind unter Berücksichtigung der Messunsicherheit praktisch keine relevanten Unterschiede mehr erkennbar. Die verbleibenden Matrix-effekte dürfen, relativ betrachtet, als tolerierbar gelten [5]. Bei höherer Matrixbelastung nimmt die Ionen-Unterdrückung hingegen ständig zu, bei manchen Analyten wie 3-Acetyl-Deoxynivalenol (3AcDON; blau), Aflatoxine (Afla; gestrichelt), Zearalenon (ZON) etc. sogar überproportional. Ochratoxin A (OTA; rot) scheint am Ende der Chromatographie am wenigsten unter den Matrixeffekten zu leiden.

Ist man im Streben nach besserer Nachweisempfindlichkeit einer Methode auch bereit, eine höhere Matrixbelastung in Kauf zu nehmen, dann ist das Wissen um die Zunahme signalunterdrückender Matrixeffekte von entscheidender Bedeutung. Es macht keinen Sinn, das System durch Reduktion des Verdünnungsfaktors mit Störstoffen über Gebühr zu belasten, wenn damit induzierte Matrixeffekte die Ionisierungseffizienz überproportional stark schwächen und eine Signalsteigerung zu sehr dämpfen.

Eine effektive Empfindlichkeitssteigerung ist nur dann zu erwarten, wenn die Matrixeffekte deutlich geringer zunehmen, als es der Konzentrationssteigerung der Matrix entspricht. Bei 3AcDON z.B. würde eine Verdoppelung der Matrixfracht von 0,5 mg auf 1 mg (bei V5 statt V10) nur eine Response-Steigerung um 43 % bewirken, während das OTA-Signal um 89 % steigen würde (Bild 5). Auf der anderen Seite verschlechtert im o.g. Beispiel die Steigerung der Verdünnung von V25 auf V100 unnötigerweise die Bestimmungsgrenzen, ohne die Wiederfindung signifikant zu verbessern.

Fazit
Leider ist es in der LC-MS/MS-Bestimmung von Mykotoxinen sowie in der Pestizidanalytik [5] nicht möglich, allgemeingültige Verdünnungsempfehlungen zu geben. Zu sehr hängt das Ausmaß der auftretenden Matrixeffekte von den technischen Gegebenheiten und insbesondere von der Analyt/Matrix-Kombina-tion ab. Eine individuelle Bewertung ist daher notwendig. Sie gelingt am effizientesten durch das beschriebene Monitoring der internen Standards.

Isotopenmarkierte Analoge von Zielanalyten sind in der LC-MS(/MS) der Königsweg zur Beherrschung von Matrixeffekten. Die Substitution möglichst aller natürlichen Kohlenstoffatome durch 13C-Isotope reduziert den Isotopeneffekt auf ein Minimum und garantiert praktisch identes Verhalten zu den nativen Vorbildern. Selbst bei sehr gut auflösender Chromatographie zeigen sich im Gegensatz zur Deuterierung keine Retentionsunterschiede. Die zeitgleiche Elution in die Ionenquelle ist die beste Voraussetzung für eine optimale Kompensation der gefürchteten Matrixeffekte. Gerade bei den für Matrixeffekte besonders anfälligen „Dilute and Shoot“-Methoden können die hohen Einzelkosten dieser internen Standards durch eine automatisierte Zugabe im Autosampler drastisch reduziert werden („online-SIVA“).

Eine zusätzliche externe Standardauswertung der internen Standards liefert mit geringstem Aufwand umfassende Informationen zu allen Matrixeffekten bei jeder einzelnen Probe und ist somit die Basis für eine zielgerichtete Methodenverbesserung.

Literatur
[1] W. Brodacz, „Matrixeffekte in der LC/MS - Strategien zu ihrer Beherrschung - Teil-1: Reduktion”; LABO 03/12; S 20-24; März 2012.
[2] W. Brodacz, „Matrixeffekte in der LC/MS - Strategien zu ihrer Beherrschung - Teil-2: Kompensation”; LABO 04/12; S 40-43; April 2012.
[3] W. Brodacz, „LC/MS-MS-Quantifizierung von Mykotoxinen - Online-SIVA direkt im Autosampler”; LABO 05/12; S 22-25; Mai 2012.
[4] A. Malachova, M. Sulyok, R. Schuhmacher, F. Berthiller, J. Hajslova, Z. Veprikova, M. Zachariasova, V. M. T. Lattanzio, S. De Saeger, J. Diana Di Mavungu, S. V. Malysheva, S. Biselli, O. Winkelmann, A. Breidbach, S. Hird, R. Krska; „Collaborative investigation of matrix effects in mycotoxin determination by high performance liquid chromatography coupled to mass spectrometry“; Quality Assurance and Safety of Crops & Foods 06/2013; 5(2):91-103; 2013.
[5] H. Stahnke, S. Kittlaus, G. Kempe, L. Alder: „Reduction of Matrix Effects in Liquid Chromatography–Electrospray Ionization–Mass Spectrometry by Dilution of the Sample Extracts: How Much Dilution is Needed“; Anal. Chem., 2012, 84 (3), pp 1474–1482, 2012.

Wolfgang Brodacz
Andreas DellaRosa
AGES Österreichische Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit Lebensmittelsicherheit – Kontaminanten-analytik, Linz
E-Mail: wolfgang.brodacz@ages.at

Anzeige

Das könnte Sie auch interessieren

Anzeige
Anzeige

Integriertes Datenmanagement

Ihre im Labor erzeugten Daten können Sie sicher und strukturiert in einem System sammeln. NEC und labfolder bieten ein Mittel für die effiziente Verwaltung großer wissenschaftlicher Datensätze an.

mehr...
Anzeige

Marktübersicht

Partikelgrößenanalysatoren

Die Partikelgrößenanalyse dient der Charakterisierung und Klassifizierung von Sedimenten und Böden, aber auch in der Lebensmittelproduktion und -qualitätskontrolle kommt diese Analysenart zur Anwendung. Aktuell erhältliche Geräte und ihre...

mehr...
Anzeige

Highlight der Woche

Integriertes Datenmanagement
Die Herausforderung bei der Digitalisierung des Laboralltags besteht im Wechsel von Papierlaborbüchern und Computerdateien zu einer Datenmanagementsoftware, die große Datensätze strukturiert innerhalb eines einzigen Systems sammelt.

Zum Highlight der Woche...

Newsletter bestellen

Immer auf dem Laufenden mit dem LABO Newsletter

Aktuelle Unternehmensnachrichten, Produktnews und Innovationen kostenfrei in Ihrer Mailbox.

AGB und Datenschutz gelesen und bestätigt.
Zur Startseite