MS/MS-Rückstandsanalytik

Die Reise eines Pestizid-Moleküls durch ein MS

Die im Folgenden beschriebene Reise aus der Sicht eines Pestizid-Moleküls entspricht einer LC/MS-MS-Multimethode der neuesten „QuEChERS“-Generation nach der grundlegenden Arbeit von Anastassiades, Lehotay, Stajnbaher und Schenck [1]. QuEChERS steht für Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe.

Wo bin ich denn hier gelandet? Mitten in einem Meer von völlig Unbekannten. Nur ganz selten sehe ich ein bekanntes Gesicht oder zumindest einen Verwandten, der mir ähnlich sieht. Wir alle werden durch eine Metallkapillare in Richtung Ausgang gespült und statt Licht am Ende des Tunnels zu sehen, spüre ich eine hohe elektrische Spannung auf mich einwirken. Und schon bin ich aus dem Tunnel ausgespuckt worden, fühle mich hoch elektrisiert und finde mich auf einem kleinen Tröpfchen in einem pneumatisch und elektrisch erzeugten riesigen Tröpfchennebel. Sehr heiße Winde wirken auf uns ein und treiben uns gemeinsam mit der elektrostatischen Anziehung voran. Wenn ich nicht ein so gebildetes Pestizid wäre, das sich durch viele kluge Artikel in der LABO technisch auf dem Laufenden hält, käme ich nie auf die Idee, dass ich in einer Elektrospray-Ionenquelle eines Massenspektrometers gelandet bin.

Langsam wird mir klar, wie ich hierhergekommen sein muss. Mein bisheriges Dasein läuft wie ein Film vor mir ab. Ich erinnere mich jetzt auch an meine gezielte und wohldosierte Ausbringung in der Landwirtschaft. Ersonnen und synthetisiert wurde ich, um den Hunger in der Welt zu bekämpfen, bzw. weniger pathetisch, um den Profit in der landwirtschaftlichen Produktion zu steigern.

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Bild 1: Wege der Pestizide zwischen den sphärischen Partikeln der HPLC-Säule.

Egal welches Pflanzenschutzmittel ich auch darstelle. Ob ich als Fungizid „meine“ Pflanze gegen Pilzbefall verteidige, gefräßigen Schadinsekten als Insektizid den Appetit verderbe, oder als Herbizid den Konkurrenzdruck durch sog. Unkräuter reduziere. Wenn ich meinen Job gut mache, blüht und gedeiht die mir anvertraute Kulturpflanze und erfreut Mensch und Tier mit ihren Nährstoffen und Vitaminen. Wenn da nur meine Rückstände nicht wären. Obwohl ich so konstruiert bin, dass ich nach Erledigung meiner Aufgabe möglichst rückstandsfrei verschwinden soll, hinterlasse ich doch oft noch winzige Spuren meiner Anwesenheit. Zumindest vor den hochentwickelten, super-sensitiven Analysenmethoden kann ich meine Vergangenheit nicht immer vollständig verbergen. Und selbst wenn ich mich auch rasch abbauen lasse, dann wird wiederum erwartet, dass meine bruchstückhaften „Hinterlassenschaften“ völlig harmlos sind. Als ausführlich geprüftes und ordentlich zugelassenes Pestizid bin ich also bestrebt, meinen Job gut zu machen und dann möglichst vollständig zu verschwinden. Für den Rest ist im wahrsten Sinn des Wortes die Rückstandsanalytik zuständig. Und um die Dimensionen darzustellen, in denen diese Rückstände gemessen werden, möchte ich hier darauf hinweisen, wie man sich die Einheit von z.B. dem sog. „ppb“ („parts per billion“; 1: 1000 000 000; µg/kg) vorstellen darf. Ein ppb entspricht ca. einer Sekunde, verglichen mit dem Zeitraum von 30 Jahren. Nur wegen dieser winzigen Rückstände werde ich oft als Täter dargestellt.

Völlig losgelöst
Als ich dann allerdings plötzlich durch einen Mixer gewirbelt und dabei von aufdringlichen Lösungsmittelmolekülen angegriffen wurde, kam ich mir eher als Opfer, denn als Täter vor. Mit der ganzen Kraft an verfügbarem Lösungsvermögen (wie gut informierte Pestizide wissen, war es vermutlich eine Kooperation von hauptsächlich Acetonitril und dem pflanzeneigenen Wasser) wurde ich von meiner Wirkstätte losgelöst und weggespült.

Bild 2: Der „Stickstoff-Vorhang“ hindert die ungeladenen Teilchen am Eindringen in die Vakuum-Zone (© AB Sciex).

Mit mir hat es auch große Mengen an unterschiedlichen und vor allem „unschuldigen“ Pflanzeninhaltsstoffen erwischt, die ebenfalls erfasst und mitgerissen wurden. Jetzt saßen wir also alle im selben Boot oder wohl eher in einem Zentrifugenröhrchen und wurden heftigst geschüttelt. Dann dringen noch spezielle Salzmischungen aus z.B. Magnesiumsulfat und Natriumchlorid zu uns vor, um die sog. Wiederfindung von uns Pestiziden zu verbessern bzw. Wasser und Zucker aus der Acetonitril-Phase zu verdrängen. Ständig wird etwas dazu gemischt, um uns dann damit ordentlich durchzuschütteln. Kaum ist das ständige Hin und Her vorbei, geht es erst richtig rund. So fühlt sich also Zentrifugieren an! Die brutalen g-Kräfte drücken alles mit nur ein wenig höherer Dichte nach unten. Nur mit Hilfe des klaren Acetonitril-Rohextraktes, der mich umgibt, kann ich mich oben halten. Davon wird auch gleich ein Aliquot abgezogen und sofort wieder mit MgSO4 und speziellen SPE-Sorbentien versetzt, in der Hoffnung, so viel als möglich der störenden Begleitstoffe abzutrennen (in der Fachsprache nennt sich das wohl „dispersive Festphasenextraktion“).

Wer die einschlägige Literatur kennt, darf jetzt auch vermuten, dass der dafür Verantwortliche nur die Kosten und Mühen scheut, uns Pestizide individuell aus dem ganzen Pflanzenmatsch herauszureinigen. Ich hätte mir da schon mehr Hingabe und ausführliche, auf die individuellen Bedürfnisse des Einzelnen abgestimmte, teure Clean-up-Verfahren erwartet. Eigentlich wollte ich dadurch schön herausgeputzt und sorgfältig wieder aufkonzentriert werden, um letztlich pfleglich behandelt der HPLC übergeben zu werden.

Bild 3: Ionen-Weg von der ESI-Kapillare zum Q1 (© Bruker).

Nein, der ungeduldige Analytiker muss ja auf modern und „QuEChERS“ machen. Mit Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe eifert er Anastassiades et al, den Erfindern dieser besonderen „Schnellreinigung“, nach und will bei seinem Chef durch Reduktion von Manpower und somit Kosteneinsparungen ordentlich Punkte sammeln. Für diese Zumutung, die mir damit angetan wird, soll er zumindest mit häufigerem Ionenquellen-Putzen bestraft werden.

Abschließend kommt wieder das unvermeidliche Geschüttle, gefolgt von der rasenden Kreisbahn. Wer das überstanden hat und sich auch hier wieder seinen Platz ganz oben bewahren konnte, der gehört zu den Auserwählten, die nicht weggeworfen werden, sondern eine besondere Analysen-Technik erleben dürfen.

Bild 4: Verdampfungszone der ESI-Tröpfchen mit Übergang in die Transferkapillare. (© Agilent Technologies)

Unter Druck geraten
Mit Tausenden Unbekannten und ganz wenigen Bekannten und Verwandten in einem kleinen Fläschchen endlich zur Ruhe gekommen, werden wir oben mit einer Teflon-beschichteten Alu-Kappe dicht verschlossen und sogar noch angenehm gekühlt. Als ich dann aber von einer eindringenden Stahlkanüle plötzlich hinweggesaugt und kurz darauf gewaltig unter Druck gesetzt wurde, war mir klar, dass man nun versuchte, mich in einem HPLC-System von meinen Mitreisenden zu trennen.

In einem Tunnel aus Stahl, der mit porösem Material fast verstopft war (Bild 1), wurde ich mit vielen unangenehmen Gesellen, auch als Matrix bekannt, ständig in die Poren gespült. Dort wurde ich minutenlang von weichen C18-Bürsten festgehalten, um doch immer wieder zu entkommen. Den Kampf um dieses Hin- und Her konnte das nachströmende Laufmittelgemisch erst für sich entscheiden, als es begann, seinen anfänglich sehr schwach ausgeprägten unpolaren Charakter kontinuierlich und massiv zu verstärken.

Bild 5: Ionen-Weg durch eine abgewinkelte Transferkapillare (© Thermo Fisher Scientific).

Elektrisiert und aufgeladen
So bin ich also in die ESI-Quelle gelangt. Es musste tatsächlich eine ESI-Ionenquelle sein, denn wo sonst wird man schon in der umgebenden Flüssigkeit elektrisiert? Außerdem müsste ich in einer APCI-Quelle (Atmospheric Pressure Chemical Ionisation) ein wahrlich herausragendes, elektrisch hoch aufgeladenes Alleinstellungsmerkmal, nämlich die Coronanadel, sehen oder zumindest spüren. Und eine APPI-Quelle (Atmospheric Pressure Photo Ionisation) wäre mit dem grellen und blendenden Licht der Krypton-Lampe nun wirklich nicht zu übersehen. Außerdem wären dann um mich herum lauter Lösungsmittelmoleküle, die durch den Photonenbeschuss ionisiert wären und mir ständig ihre Ladungen aufdrängen würden.

Also eindeutig Elektrospray. Ist ja in der Pestizidanalytik auch am weitesten verbreitet (LABO-Lesen bildet!). Damit wurde mir auch klar, was jetzt auf mich zukommen würde, nämlich, dass es verdammt eng wird beim Ritt auf dem kleinen Tröpfchen. Mehrere hundert Grad heißes N2-Gas lässt meine kugelförmige Unterlage rapide schrumpfen. Es wird immer enger, denn der Platz an der Oberfläche schwindet schnell. Die ganzen grässlichen „Matrixler“ rücken mir schwitzend bei der Hitze immer näher und wollen mich wegdrängen. Ich verabscheue diese „Dreckskerle“ zumindest genauso, wie der Betreiber des hochempfindlichen Instruments.

Bild 6: Ionen fliegen in eine Transferkapillare mit sechs parallelen Bohrungen zur Verbesserung der Sensitivität. (© Agilent Technologies)

Ich gehöre aber letztlich zu ca. 50 000 Auserwählten, die eine Ladung ergattert haben und sie festhalten können, denn mein Naturell hat mich rechtzeitig dazu gedrängt, das nächstbeste H+ zu schnappen und mich dadurch positiv aufzuladen.

Die Erfinder diese Maschine würden das jetzt Protonierung nennen, was mir aber herzlich egal ist. Ich bin nämlich nicht allein – leider. Tausende positiver Ladungen müssen immer mehr zusammenrücken, obwohl sie sich naturgemäß hassen und gegenseitig äußerst abstoßend finden. Nur die Oberflächenspannung behält noch die Oberhand, arbeitet verzweifelt dagegen und zwängt uns noch zusammen. Sie ist aber schon zum Zerreißen gespannt und ihre Mühe wird letztlich doch vergeblich sein.

Bild 7: Der Z-förmige Weg der Analyten fördert die Verdampfung und die Abscheidung ungeladener Partikel. (© Waters)

Explodiert und zerkleinert
Dann plötzlich, mit einem Knall, verliert die Oberflächenspannung den Kampf um den Zusammenhalt, und die Abstoßung der gleichen Ladung entspannt die Situation in einer regelrechten Explosion, die unter Fachleuten als Coulomb-Explosion bekannt ist. Die auseinanderfliegenden Teilchen formieren sich durch die wiederaufkeimende Oberflächenspannung sofort wieder zu noch kleineren Flüssigkeitströpfchen, auf denen sich dasselbe wieder von neuem abspielt. Und auch diese spektakulären Coulomb-Explosionen wiederholen sich in mehreren Kaskaden immer wieder. Letztlich finde ich mich in einem so winzigen Tröpfchen wieder, das im Nu völlig verdampft ist und mich als nacktes, positiv geladenes (protoniertes) Pestizidmolekül (M+H)+ in die Normaldruck-Freiheit des Ionenquellenraumes entlässt.

Dass beim Verteilungskampf um die beschränkte Anzahl an Ladungen die gefürchteten sogenannten Matrixeffekte entstehen, lässt mich in diesem Fall völlig kalt. Erstens habe ich meine Wunschladung abbekommen und zweitens ist die Kompensation der meist auftretenden Signalunterdrückungen das Problem des verantwortlichen Analytikers. Wenn er nicht mit einem übergewichtigen Zwilling von mir, sorry – ich meine natürlich Isotopologen – vorgesorgt hat, dann wird er (hoffentlich) schon merken, dass er bei der Quantifizierung ziemlich daneben liegen kann. Wenn er dann auch noch darauf verzichtet, im Beisein exakt derselben Matrix zu kalibrieren oder zu faul für eine Standard-addition ist, wird er spätestens beim Audit sein Fett abbekommen.

Bild 8: Abgewinkelter Ionen-Transfer durch die ESI-Quelle (© Shimadzu).

Wie schon im Schutz der Tröpfchen werde ich jetzt, allerdings auf mich allein gestellt, von der Säulenkapillare weiterhin abgestoßen und von einem großen, negativ geladenen Metallteil mit einer winzigen Öffnung angezogen wie von einem schwarzen Loch. Während ich noch unter Atmosphärendruck auf das Orifice genannte Loch zufliege, bemerke ich auch den extremen Sog dieser magischen Öffnung, hinter der großes Vakuum herrschen muss.

Beim Eindringen in das Orifice schlägt mir brutal ein N2-Sturm entgegen, der mich zumindest von anhaftenden Lösungsmittelresten befreit (Bild 2). Eine Menge störender Neutralteilchen, die auch vom Vakuum angezogen werden, müssen sich dem N2-Orkan ergeben und werden radikal zurückgeworfen. Nur mit der elitären Kraft der Anziehung meiner positiven Ladung kann ich diesen restriktiven N2-Vorhang überwinden. Diese Abschirmtechnik verrät mir auch, dass ich mich vermutlich in einer TurboV-Ionenquelle der Fa. AB Sciex oder im Bruker EVOQ (Bild 3) befinden könnte. Denn ich weiß, dass ich bei Agilent (Bild 4) und Thermo (Bild 5) durch eine extrem heiße Transferkapillare fliegen müsste. Beim neuesten Agilent ist diese leicht an den sechs Bohrungen erkennbar (Bild 6). Waters hätte ich sofort am verwinkelten Weg durch die Z-Spray-Quelle (Bild 7) erkannt, und bei Shimadzu (Bild 8) wäre ich auch mehrfach abgebogen.

Bild 9.: Perspektiven aus der Sicht eines Pestizids im Q1 des Triple Quads. (© AB Sciex (Video-Screenshots aus http://www.youtube.com/watch?v=VUmcxNLHu4Y&feature=relmfu)

Somit hat das Gedränge mit den Neutralen endlich aufgehört. Nur noch unter Gleichgeladenen, wenn auch nicht Gleichartigen, geht es jetzt rasant voran. Wer Beschleunigungen mag, der wird das Kommende lieben. Noch einmal von Linsen gebündelt und fokussiert, schießen wir als Ionen in das Zentrum der Stirnseite von vier parallelen, im Quadrat angeordneten Metallstäben (Q1; Bild 9).

Separiert und sortiert
Kaum kommt mir der Name „Quadrupol“ in den Sinn, wird mir selbiger durch ein wirres, schraubenförmiges Hochfrequenz-Gezerre geraubt. Ich bemerke nur noch, dass ich fast alle meiner gleichgeladenen Schicksalskollegen durch brutale Kollisionen mit den Quadrupol-Rods verliere. Zum Glück ist der Massenfilter gerade optimal auf mein Masse-zu-Ladungs-Verhältnis eingestellt und ich überstehe diesen wilden Ritt im elektrischen Wechselfeld ohne Kollision und Entladung. Rund um mich sind nur noch wirklich Gleichartige im Sinne von selber Ladung und gleichem Gewicht übriggeblieben. Obwohl, einige wenige haben trotz gleicher Masse schon noch eine etwas andere Gestalt.

Bild 9.: Perspektiven aus der Sicht eines Pestizids in der Stoßzelle Q2 des Triple Quads. (© AB Sciex (Video-Screenshots aus http://www.youtube.com/watch?v=VUmcxNLHu4Y&feature=relmfu)

Zerschlagen und aufgeteilt
Bevor ich aufatmen kann und mich auf den unvermeidlichen Einschlag in einem Detektor gefasst mache, trifft mich der Schlag, pardon - ein N2-Molekül, das mir in meiner rasenden Fahrt plötzlich im Weg steht und vom Querverkehr stammen muss. Soll ich nun erleichtert sein, dass der Betreiber dieser Höllenmaschine keine Kosten gescheut hat und statt in ein Single-Quad in ein hochselektives Triple-Quadrupol-System investiert hat? Oder wiegt der Verlust eines großen Teils meiner Struktur schwerer? Ich bin nämlich in einem Quadrupol-ähnlichen Raum, der Stoßzelle genannt wird, von N2-Molekülen angefallen und in Stücke geschlagen worden (Q2; Bild 9). Da ist es mir auch kein Trost, dass der Stickstoff wieder meine Vermutung mit AB Sciex oder Bruker bestätigt, denn Waters und Thermo nehmen gerne Argon, weil es Dank größerer Masse brutaler zuschlagen kann.

So muss ich mich von meinen unfreiwillig abtrünnigen Fragmenten verabschieden, ohne zu ahnen, dass ich gemeinsam mit zumindest einer Sorte davon, noch etwas Wichtiges vollbringen werde. Zunächst aber verlieren wir uns aus den Augen, denn wir werden gesondert der nächsten Quadrupol-Prüfung unterzogen (Q3; Bild 9). Wieder vollführen wir einen irren Tanz zwischen den vier hyperbolisch geschliffenen Stäben, den so genau nur die Mathieu-Gleichung beschreiben kann. Der Unterschied zu früher: Die gleichgewichtige Konkurrenz ist weg. Nur noch absolut sortenreine Gestalten umgeben mich jetzt. Und die landen alle mit einem harten Aufschlag im Elektronenmultiplier, wie das belesene Pestizidfragment weiß.

Bild 9.: Perspektiven aus der Sicht eines Pestizids bzw. dessen Fragment im Q3 des Triple Quads. (© AB Sciex (Video-Screenshots aus http://www.youtube.com/watch?v=VUmcxNLHu4Y&feature=relmfu)

Aufgeschlagen und registriert
Damit unser langer, abwechslungsreicher Trip durch die moderne Analysentechnik nicht umsonst war, schlagen wir hier noch einmal ordentlich auf den Putz des Elektronenvervielfältigers, damit der endlich auch seinen Job machen und unter ordentlicher Hochspannung diese eben herausgeschlagenen Elektronen möglichst zahlreich vervielfältigen kann.

Somit haben wir eine Spur, und sei es nur eine kleine Ionen-Trace hinterlassen, und unsere Reise hat einen tieferen Sinn gehabt, denn fein säuberlich zusammenaddiert ergeben wir letztlich eine stärkere Spur. Hauptsache sie ist zumindest dreimal so stark wie das ständig vorhandene Rauschen. Mit diesem Lebenszeichen erlangen wir in der Analytik in Form eines verrauschten Peaks immerhin die Anerkennung als „Limit of Detection“ (LOD) und existieren damit.

Wolfgang Brodacz; AGES Lebensmittelsicherheit - Kontaminantenanalytik, Linz

Zumindest eines meiner Ziele ist erreicht: Eine Spur zu hinterlassen und als Teil eines Peaks ernst genommen zu werden. Besonders glücklich dürfen sich jene schätzen, die noch einmal mehr als dreimal so stark auftreten können, denn sie müssen sogar als „Limit of Quantifcation“ (LOQ) anerkannt werden und machen ihrem Entdecker noch mehr Freude oder eben deshalb auch wieder nicht. Jetzt darf uns der Analytiker sicher nicht mehr ignorieren und damit können wir ihm noch einiges an Arbeit abverlangen. Zuerst muss er genau prüfen, ob wir zum richtigen Zeitpunkt auftauchen – Stichwort: Retentionszeitfenster. Wir liegen genau in der Mitte – Pech für bequeme Analytiker!

Zeichen gesetzt
Jetzt darf er Verhältnisse rechnen, vergleichen und deren zulässige Abweichungen ermitteln. Wäre doch zu einfach gewesen, wenn wir aus seiner Sicht die S/N-Hürde von 10 nicht geschafft hätten. Um seinen Arbeitsauftrag perfekt zu machen, sollten meine abgetrennten Fragmente aus der Kollisionszelle diese Hürde auch schaffen.

Und da treffen die beiden (oder sogar mehrere) Töchter einer gemeinsamen Mutter zumindest rechnerisch wieder aufeinander. Überpenible lassen die Bezeichnungen dieses „Familientreffens“ aus politischer Korrektheit aber nicht mehr zu, und fordern die Umbenennung in Produkt-Ionen eines gemeinsamen Precursor-Ions. Davon wird die Analytik allerdings auch nicht besser, ja nicht einmal verständlicher. Zumindest klingt sie damit internationaler. Hauptsache, das numerische und auch graphische Treffen von (zumindest) zwei Produkt-Ionen findet statt und gibt Klarheit über die Verhältnisse. Und genau die sind es, die jetzt über Sein oder Nichtsein entscheiden.

Wiedervereinigt, verglichen und entdeckt
Mit Reinsubstanzen, das sind quasi in Einzelhaft gehaltene pure Gleichartige, wird bei der Kalibrierung penibel genau dieselbe Tortur veranstaltet, nur um deren exakte Retentionszeit und das Familienverhältnis – pardon, deren Intensitätsverhältnis – exakt festzustellen. Ehemals freilaufende und jetzt analytische Gefangene derselben Art verraten sich dann, innerhalb definierter Abweichungen, mit sehr ähnlichen Retentionszeiten und fast gleichen Ratios derselben Ionen. Dieses Verfahren nennt sich Target-Screening, d.h. der Analytiker weiß ganz genau was er sucht und ich stehe auf seiner „Watch List“.

Zum Schluss stelle ich mir rückblickend noch die Frage: Welche Alternativen hätte ich als Pestizid gehabt? Unentdeckt auf oder in meiner Pflanze haften zu bleiben und gefressen bzw. – welch Ehre – vielleicht sogar gegessen zu werden? Eine Reise durch den Verdauungstrakt mit abschließender, unehrenhafter Ausscheidung ist sicher nicht so spannend und technisch nicht so interessant wie mein High-Tech-Erlebnis!

Literatur
[1]
M., S. J. Lehotay, D. Stajnbaher and F. J. Schenck. „Fast and easy multiresidue method employing acetonitrile extraction/partitioning and dispersive solid-phase extraction for the determination of pesticide residues in produce.“ Journal of AOAC International 86 (2): 412-31; 2003).

Autor:
Wolfgang Brodacz
AGES Lebensmittelsicherheit - Konta- minantenanalytik, Linz
wolfgang.brodacz@ages.at

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