Hydrophobe Interaktionschromatographie

Charakterisierung von monoklonalen Antikörpern und verwandten Produkten via HIC-MS

Hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC) ist eine der LC-Standardtechniken für die Analyse von monoklonalen Antikörpern (MAbs) und Antikörper-Wirkstoff-Konjugaten (ADCs). Die nativen Bedingungen bieten für die Proteinanalytik entscheidende Vorteile, da die Proteine bei der Analyse nicht zerstört werden und in ihrer nativen Form charakterisiert werden können. Deshalb ist eine Kopplung an ein natives Massenspektrometer (MS) wünschenswert. So wird eine aufwendige Isolation unnötig.

Bild 1: Aufbau mit Make-up-Fluss und Splitter. © Bild: Yan et al. [1], modifiziert YMC

Für gewöhnlich werden im HIC-Modus nicht flüchtige Salze wie Ammoniumsulfat in hohen Konzentrationen (1 – 2 M) verwendet. Daher ist eine Kopplung mit MS nahezu unmöglich. Werden flüchtige Salze wie Ammoniumacetat im HIC-Modus verwendet, muss die Salzkonzentration erhöht werden, um einen vergleichbaren Aussalzeffekt zu erzielen. Anstelle von 2 M Ammoniumsulfat-Lösung wird stattdessen 5 – 5,5 M Ammoniumacetat-Lösung eingesetzt, so dass eine direkte Kopplung an ein Massenspektrometer zwar herausfordernd, doch durchaus realisierbar ist.

Eine Lösung für HIC-MS

In den Studien von Yan et al. wird HIC mit nativer MS direkt gekoppelt [1]. Dies ermöglicht die Kombination aus „Make-up“-Fluss und einem Flussteiler (Splitter), s. Bild 1. Durch den „Make-up“-Fluss mit 100 % Wasser wird die Salzkonzentration verringert. Der Splitter ermöglicht die gleichzeitige Detektion mittels UV und MS, wobei die Flussrate reduziert wird, so dass diese für die Nanospray Ionisation (NSI) geeignet ist. Nanospray Ionisation ist in diesem Fall durch die hohe Sensitivität und Salztoleranz besonders gut geeignet.

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Chromatographische Bedingungen. Quellen: Yan et al. [1], YMC

Als Säule wurde „BioPro HIC BF“, eine unporöse Säule mit Butylliganden von YMC, für die Trennung von sieben MAbs, zwei MAb-Proben mit durch posttranlationalen Modifikationen (PTMs) induzierten Spezies und einer Cystein-konjugierten ADC-Mimik verwendet.

HIC-MS einer MAb-Mischung

Bild 2: Chromatogramm und Massenspektren einer MAb-Mischung [2]. © Bild: Yan et al. [1], mit freundlicher Genehmigung von S. Wang, Regeneron Pharmaceuticals Inc.

Sieben verschiedene MAbs wurden unter Verwendung eines 16 min-Gradienten (von 3 M – 300 mM Ammoniumacetat-Lösung) analysiert. Es wurden sechs sehr gut getrennte Peaks erhalten. Die Injektion von 3 – 6 µg pro MAb war ausreichend, um Spezies geringer Häufigkeit eines MAbs wie nicht glykolysierte und teilweise glykolysierte Spezies zu detektieren (s. Bild 2).

Lediglich zwei MAbs (MAb 5 und MAb 6) konnten nicht getrennt werden. Das Dekonvolutionsspektrum zeigt außerdem, dass MAb 5 und dessen oxidierte Form getrennt wurden (Peaks 4 und 5).

MAb-Varianten

Bild 3: Chromatogramme und Massenspektren der MAb-Varianten, induziert durch PTM [3]. © Bild: Yan et al. [1], mit freundlicher Genehmigung von S. Wang, Regeneron Pharmaceuticals Inc.

Zwei MAbs mit posttranslationalen Modifikationen (PTMs) an oder in der Nähe der komplementaritätsbestimmenden Region (CDR) wurden charakterisiert. Die Spezies konnten mindestens partiell getrennt werden, Injektionen von jeweils 10 µg MAb 8 und MAb 9 zeigten je einen Nebenpeak, der leicht früher eluierte, so dass molekulare Spezies mit reduzierter Hydrophobizität angenommen werden können. Die Massenbestimmung zeigte zwei Hauptformen für MAb 8 und ein oxidiertes Produkt von MAb 9 (s. Bild 3).

Wirkstoff-zu-Antikörper-Verhältnis (DAR) einer ADC-Mimik

Bild 4: DAR-Bestimmung und Massenspektren der SigmaMAb-ADC-Mimik [4]. © Bild: Yan et al. [1], mit freundlicher Genehmigung von S. Wang, Regeneron Pharmaceuticals Inc.

IgG1 (Immunglobulin G 1) wurde mit Dansylfluorophoren an Cysteingruppen der Disulfidbrücken konjugiert, was in einer Beladung von 0 – 4 Paaren resultiert. Die erhaltene Trennung ist ähnlich der vom Hersteller angegebenen HIC-UV-Methode, bei der Ammoniumsulfat und Isopropanol verwendet wurde. Das Wirkstoff-zu-Antikörper-Verhältnis sowie Abbauprodukte konnten bestimmt werden (s. Bild 4).

Schlussfolgerung

Diese Studie [1] zeigt, wie HIC direkt an MS trotz hoher Salzkonzentrationen gekoppelt werden kann. Dabei wurde die Lösung eines flüchtigen Salzes, und zwar Ammoniumacetat, anstelle der sonst verwendeten nicht-flüchtigen Salze verwendet. Ein sog. Make-up-Fluss verdünnt die hohe Salzkonzentration, um die Kopplung zum Massenspektrometer zu ermöglichen. Zusätzlich reduzierte ein Splitter hierfür die Flussrate auf 1 – 5 µl/min. Durch Kombination aus einer Säule mit hoher Reproduzierbarkeit, wie hier der Säule „BioPro HIC BF“ von YMC, und einem Nanospray-Ionisationsmassenspektrometer wird eine hochsensitive und robuste Methode ermöglicht.

Referenzen:

  1. Yan, T. Xing, S. Wang, T. J. Daly, N. Li, “Online coupling of analytical hydrophobic interaction chromatography with native mass spectrometry for the characterization of monoclonal antibodies and related products”, J. Pharmaceut. Biomed., 2020, 186, 113313.
  2. YMC Co., Ltd., Application Note, “Online native HIC-MS analysis of a monoclonal antibody mixture”, 2020, W200519A
  3. YMC Co., Ltd., Application Note, “Online native HIC-MS analysis of a monoclonal antibody molecular variants”, 2020, W200519B
  4. YMC Co., Ltd., Application Note, “Online native HIC-MS analysis of cys-linked ADCs”, 2020, W200519C

AUTORIN
Ann Marie Rojahn
YMC Europe GmbH
a.rojahn@ymc.de
www.ymc.de

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