LC-MS/MS für Forensik und Toxikologie

Prof. Dr. Harald John,

Fingerabdruck der Pestizidvergiftung

Der bioanalytische Nachweis von Vergiftungen mit phosphororganischen Substanzen ist sowohl forensisch und toxikologisch als auch diagnostisch von großer Relevanz. Eine Kombination unterschiedlicher Verfahren zur Detektion von Biomarkern, die einen phosphylierten Tyrosinrest enthalten, haben der Autor und seine Arbeitsgruppe kürzlich als „Toolbox für den Nachweis von Pestizidvergiftungen“ zusammengefasst.

Der bioanalytische Nachweis von Vergiftungen mit phosphororganischen Substanzen ist sowohl forensisch und toxikologisch als auch diagnostisch von großer Relevanz.

Zur Gruppe der phosphororganischen Gifte (OP = Organophosphorverbindungen) gehören zivil genutzte Pestizide, aber auch einst für militärische Zwecke vorgesehene Nervenkampfstoffe. Intoxikationen mit OP können akzidentell oder absichtlich erfolgen. Das vorsätzliche Verschlucken von Pestizidlösungen in suizidaler Absicht gehört insbesondere im asiatischen Raum noch immer zu den häufigen Methoden der Selbsttötung. Chronische Pestizidexpositionen bei Landarbeitern und Attentate mit Nervenkampfstoffen wie jüngst auf den Halbbruder des nord-koreanischen Machthabers am Flughafen in Malaysia sowie den ehemaligen russischen Doppelagenten Skripal in England oder der Einsatz von Sarin im Syrienkonflikt stellen weitere Beispiele gesundheitsgefährdender und tödlicher Vergiftungen mit OP dar.

Der bioanalytische Nachweis solcher Vergiftungen ist daher sowohl forensisch und toxikologisch wie auch diagnostisch von großer Relevanz. Viele OP unterliegen im Körper einem schnellen Abbau. Die polaren Biotransformationsprodukte werden über den Urin innerhalb weniger Tage ausgeschieden. Die unveränderten OP unterliegen häufig einer vergleichbar schnellen Elimination und können somit schon nach wenigen Tagen nicht mehr zum Nachweis der Vergiftung dienen. Im Gegensatz dazu repräsentieren die Reaktionsprodukte zwischen den OP und körpereigenen Proteinen langlebige Strukturen, die auch noch Wochen nach Exposition im Blut oder im Gewebe existent sind.

Anzeige

Diese Strukturen stellen Zielmoleküle dar, die seit einiger Zeit im Fokus unserer Forschung stehen, um forensische Methoden für die Post-Expositionsanalyse zu etablieren. Die relevanten Verfahren basieren auf moderner Microbore-Flüssigchromatographie (µLC: Trennsäulen mit 1 mm Innendurchmesser und Flüssen von ca. 30 µl/min) in Kopplung mit Elektrospray-Ionisation (ESI) und Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS). Sie konnten wiederholt zum Nachweis der Vergiftung mit Nervenkampfstoffen und Pestiziden von uns eingesetzt werden [1 – 4]. Dieser Artikel stellt die experimentellen Möglichkeiten und Anwendungen vor.

Proteine als endogene Adduktbildner
Die giftige Wirkung der OP beruht auf der chemischen Reaktion mit dem Enzym Acetylcholinesterase (AChE). Die kovalente Bindung (Phosphylierung: Bindung des Phosphylrestes des OP unter Abspaltung der Abgangsgruppe, Bild 1) an das aktive Zentrum der AChE ruft durch Inhibition des Enzyms die toxikologischen Wirkungen hervor [5]. Diese können sich in einer cholinergen Krise manifestieren. Sie zeigt sich u. a. in Pupillenverengung, Muskelzuckungen, Krämpfen und verstärkter Sekretion von Speichel, Urin und Schweiß und kann letztendlich durch Atemstillstand zum Tod führen. Während diese Proteinbindung (Addukt) ursächlich für die Giftigkeit der OP ist, gibt es Addukte mit anderen Proteinen, die nach aktueller Lehrmeinung nicht pathophysiologisch relevant sind. Diese zusätzlichen Addukte haben sich jedoch als wertvolle Zielstrukturen für den bestätigenden bioanalytischen Nachweis (Verifikation) von Expositionen gegenüber OP erwiesen [5]. Zu diesen Proteinen gehören insbesondere die Butyrylcholinesterase (BChE, Plasmacholinesterase) und das humane Serumalbumin (HSA) [5]. Diese Proteine besitzen bestimmte Aminosäuren, deren Seitenketten ob ihrer hohen Nukleophilie eine hohe Reaktivität gegenüber OP aufzeigen. Ähnlich wie bei der AChE reagiert die strukturhomologe BChE mit der Hydroxylfunktion des Serinrestes aus dem esteratischen Zentrum. Im HSA haben sich hingegen die Hydroxylfunktionen bestimmter Tyrosinreste als besonders zugänglich für Phosphylierungen gezeigt (Bild 2).

Bild 1: Phosphororganische Pestizide. Die Biotransformation in der Leber durch Cytochrom P450 Enzyme (CYP) generiert aus Thiono-Pestiziden (Parathion-ethyl) ihre deutlich giftigeren Oxono-Verbindungen (Paraoxonethyl) oder oxidiert Abgangsgruppen (Demeton-S-methylsulfon). Die Phosphorylreste (dargestellt in blau und rot) binden sich beispielsweise an Tyrosinreste im Serumalbumin und thiolhaltige Abgangsgruppen (dargestellt in braun und grün) an freie Cysteinreste, die als Biomarker der Vergiftung dienen können. © Grafik: Prof. Dr. Harald John, Bundeswehr

Der Nachweis dieser chemischen Modifikationen über massenspektrometrische Analyse des kompletten Proteins lässt sich nur mit unzureichender Selektivität und Sensitivität ermöglichen. Daher werden diese Proteine einer proteolytischen Spaltung unterzogen, die möglicherweise eine vorhergehende Isolierung des Proteins aus Plasma oder Gewebehomogenaten erfordert (Bild 3). Ähnlich den gängigen Techniken der Proteomanalyse zur Identifizierung von Proteinen werden danach die peptidischen Spaltprodukte chromatographisch getrennt und massenspektrometrisch fragmentiert und detektiert (Bild 2). Die Phosphylierungen bleiben bei Isolierung und Proteolyse erhalten und lassen sich über ihren häufig individuellen Massenzuwachs auf peptidischer Ebene selektiv nachweisen. Diese Biomarker erlauben somit mittels µLC-ESI MS/MS den eindeutigen Beleg für die Inkorporation von OP.

µLC-ESI MS/MS Nachweis von BChE-Addukten
Die humane BChE liegt im Plasma als Tetramer (ca. 380 kDa) in einer relativ geringen Konzentration von nur ca. 4 µg/ml vor [5]. Diese geringe Konzentration macht die vorherige Isolierung aus Plasma und Gewebehomogenaten unabdingbar. Die modernste und effizienteste Methode der BChE-Extraktion besteht in der immunomagnetischen Separation (IMS); s. Bild 3 [6]. Ein geringes Plasmavolumen von nur 200 µl wird mit magnetischen Beads versetzt, an deren Oberfläche monoklonale Antikörper (mAb) aus der Maus immobilisiert sind, die mit hoher Selektivität die humane BChE und ihre Addukte binden. Die kommerziell erhältlichen mAb werden zuvor durch Inkubation an Beads gebunden, deren Oberflächen bereits mit Protein G belegt worden sind. Wird die Plasmaprobe mit den Beads in ein magnetisches Feld gebracht, werden die Beads an die Gefäßseiten gezogen, und die klare, flüssige depletierte Plasmafraktion lässt sich abpipettieren und so von der immobilisierten BChE trennen (Bild 3).

Nach einem Waschschritt werden die Beads mit einer Pepsinlösung in Ameisensäure versetzt, um innerhalb von 2 h bei 37 °C die BChE proteolytisch zu spalten (Bild 3). Diese Prozedur generiert ein Nonapeptid, welches den phosphylierten Serinrest enthält [5]. Nachfolgend werden die kleinen Peptide und der Biomarker aus der Inkubationsmatrix durch Ultrafiltration (UF, 10 kDa cut-off) von verbliebenen großen Proteinen getrennt. Das Filtrat lässt sich nun unmittelbar mittels µLC-ESI MS/MS analysieren (Bild 3).

Bild 2: Biomarker aus humanen Serumalbumin-Addukten zum Nachweis der Vergiftung mit Pestiziden. Die Proteolyse von Albumin mit verschiedenen Enzymen (Pepsin, Trypsin, Pronase) generiert mehrere Biomarker, die mittels μLC-ESI MS/MS detektiert werden können (Pestizid Toolbox) [2, 4]. © Grafik: Prof. Dr. Harald John, Bundeswehr

Wie für Peptide üblich, erfolgt die µLC-Separation über eine reverse C18-Phase unter Verwendung eines Acetonitril-Gradienten [6]. Das phosphylierte und protonierte Nonapeptid dient als Vorläuferion in der MS/MS- Detektion und die Übergänge auf drei selektive Produktionen werden im multiple-reaction monitoring Modus (MRM) aufgezeichnet. Diese Methode ermöglicht den Nachweis von deutlich subletalen Giftmengen bis zu vier Wochen nach Exposition [5].

µLC-ESI MS/MS-Nachweis von HSA-Addukten
Das Prinzip des HSA-Addukt-Nachweises ist ähnlich dem oben beschriebenen BChE-Addukt-Verfahren. Da HSA jedoch mit einer Konzentration von ca. 40 mg/ml im Plasma das höchst abundante Protein ist, kann auf eine initiale Extraktion typischerweise verzichtet werden (Bild 3). Im Gegensatz zur BChE reagieren bestimmte Tyrosinreste im HSA jedoch auch mit Thiono-Pestiziden (Bild 1), die wegen ihrer geringeren Säugertoxizität häufiger in der Landwirtschaft eingesetzt werden als ihre Oxono-Analoga. Letztere werden dann erst im Organismus in Folge einer chemischen Umwandlung in der Leber (Desulfurierung durch Cytochrom P450 Enzyme) aus den Thiono-Pestiziden gebildet (Bild 1). Zur Detektion von Biomarkern, die einen phosphylierten Tyrosinrest enthalten, bieten sich verschiedene Proteasen an. Eine Kombination dieser unterschiedlichen Verfahren haben wir jüngst als eine Toolbox für den Nachweis von Pestizidvergiftungen zusammengefasst (Bild 2) [2].

In einem Ansatz wird die Plasmaprobe (100 µl) mit Acetonitril zur Proteinpräzipitation versetzt, um anschließend das gewaschene Proteinpellet mit dem Enzym Pronase (eine Mischung von 20 verschiedenen Endo- und Exopeptidasen) aufzulösen (Bild 2). Der Zusatz von Pronaselösung sorgt innerhalb von 2 h bei 37 °C für die Degradation des HSA unter Bildung einzelner Aminosäuren oder kürzester Peptide (Di- bis Tetrapeptide). So wird phosphyliertes Tyrosin (Y*) als Biomarker freigesetzt, welcher sich nach UF im Filtrat über µLC-ESI MS/MS selektiv detektieren lässt. Exemplarisch präsentiert Bild 2 diese Biomarker des Thiono- und Oxono-Phosphorylrestes, die sich in einem realen Parathion-ethyl-Vergiftungsfall nachweisen ließen [2].

Bild 3: Probenvorbereitung von humanem Serum oder Plasma zum Nachweis der Pestizid-Addukte mit Butyrylcholinesterase und Serumalbumin. © Grafik: Prof. Dr. Harald John, Bundeswehr

In einem parallelen Aufarbeitungsschritt wird das Proteinpellet von 100 µl Plasma mit einer Pepsinlösung vermischt. Nach 2-stündiger Inkubation bei 37 °C wird das Inkubat ultrafiltriert (10 kDa cut-off), um im Filtrat via µLC-ESI MS/MS das phosphylierte Hexapeptid LVRY*TKKVPQVSTPTL nachzuweisen (Bild 2). Die massenspektrometrische Fragmentierung dieses Biomarkers generiert diagnostische Produktionen, die neuerlich hoch-selektiv und empfindlich den Beweis einer OP-Vergiftung erlauben. Bild 2 zeigt die Resultate des realen Parathion-ethyl-Vergiftungsfalles [2].

In einem dritten parallelen Aufarbeitungsschritt werden 100 µl Plasma initial ultrafiltriert, um anschließend die Proteine des Retentates durch Zugabe von Dithiotreitol zu reduzieren und die freien Thiol-Funktionen der Cysteinreste mit Iodacetamid zu carboxamidomethylieren [2]. Nach neuerlicher UF wird das Retentat mit 50 mM NH4HCO3 und Trypsin-Lösung inkubiert (5 h, 37 °C). Dieses Verfahren produziert das phosphylierte Tripeptid Y*TK, welches nach Trennung über C18-Material mittels µLC-ESI MS/MS erfasst werden kann (Bild 2).

Somit erlaubt die beschriebene Toolbox die Detektion von drei verschiedenen Biomarkern sowohl für die Thiono- wie auch Oxono-Variante der Pestizide (Bild 2). Diese vordergründige Redundanz ist jedoch erforderlich, da nach den Regeln der Organisation für das Verbot Chemischer Waffen (OVCW) mindestens zwei verschiedene Biomarker detektiert werden müssen oder ein Biomarker mit zwei verschiedenen Methoden erfasst sein muss, um einen eindeutigen und verifizierbaren Beleg einer Vergiftung zu gewährleisten [1].

Über die beschriebenen Tyrosinaddukte hinaus haben wir jüngst eine neue Klasse von HSA-Addukten vorgestellt [3, 4, 7, 8], die durch die chemische Anbindung der thiolhaltigen Abgangsgruppe von Pestiziden oder Nervenkampfstoffen an ein freies Cystein entstehen. Oxydemeton-methyl und sein Biotransformationsprodukt Demeton-S-methylsulfon sind, wie in Bild 1 gezeigt, Beispiele solcher Pestizide. Die entstehenden Disulfid-Addukte nach Pronase-Spaltung (Bild 2) erlaubten in realen Fällen beispielsweise den Nachweis der Vergiftung durch die Pestizide Dimethoat und Omethoate [3] sowie Oxydemeton-S-methyl und Demeton-S-methylsulfon [4].

Fazit
OP-Pestizide phosphorylieren körpereigene Proteine wie BChE und HSA und bilden dabei relativ stabile Addukte, die als Biomarker dem Nachweis einer Vergiftung dienen können. Der Einsatz verschiedener Proteasen zur Spaltung von HSA-Addukten generiert unterschiedlich lange Peptide, die entweder einen phosphorylierten Tyrosinrest besitzen oder einen Cysteinrest, der durch eine thiolhaltige Abgangsgruppe bestimmter Pestizide modifiziert wurde. Die anschließende Detektion dieser neuartigen Peptidkollektion über µLC-ESI MS/MS ermöglicht den eindeutigen Nachweis einer Vergiftung [2– 4]. Dies gelingt auch dann noch, wenn andere kleinere und polare Expositionsmarker schon aus dem Körper ausgeschieden wurden. So erweitert die Pestizid Toolbox erwiesenermaßen entscheidend die diagnostischen und insbesondere forensischen Möglichkeiten des Giftnachweises.

Literatur:
[1] John et al. Fatal sarin poisoning in Syria 2013: forensic verification within an international laboratory network. Forensic Toxicology 2018, 36, 61 – 71.
[2] von der Wellen et al.: A toolbox for microbore liquid chromatography tandem-high-resolution mass spectrometry analysis of albumin-adducts as novel biomarkers of organophosphorus pesticide poisoning. Toxicology Letters 2018, 292, 46 – 54.
[3] Kranawetvogl et al.: Verification of organophosphorus pesticide poisoning: Detection of phosphorylated tyrosines and a cysteine-proline disulfide-adduct from human serum albumin after intoxication with dimethoate/omethoate Toxicology Letters (im Druck).
[4] John et al.: Novel cysteine- and albumin-adduct biomarkers to prove human poisoning with the pesticide oxydemeton-S-methyl Toxicology Letters 2018, 294, 122 – 34.
[5] John et al.: Toxicokinetic aspects of nerve agents and vesicants. In: Gupta, R.C. (Ed.). Handbook of Toxicology of Chemical Warfare Agents. 2015, 2nd edition Academic Press/Elsevier, Amsterdam, NL, pp. 817 – 856 (Chapter 56).
[6] Sporty et al.: Immunomagnetic separation and quantification of butyrylcholinesterase nerve agent adducts in human serum. Anal. Chem. 2010, 82, 6593 – 6600.
[7] Kranawetvogl et al.: Modification of human serum albumin by the nerve agent VX: microbore liquid chromatography/electrospray ionization high-resolution time-of-flight tandem mass spectrometry method for detection of phosphonylated tyrosine and novel cysteine containing disulfide adducts. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2016, 30, 2191 – 2200.
[8] Kranawetvogl et al.: Bioanalytical verification of V-type nerve agent exposure: simultaneous detection of phosphonylated tyrosines and cysteine-containing disulfide-adducts derived from human albumin. Anal. Bioanal. Chem. 2018, 410, 1463 – 474.

AUTOR
Prof. Dr. Harald John
Institut für Pharmakologie und Toxikologie der Bundeswehr, München

Anzeige

Das könnte Sie auch interessieren

Anzeige
Anzeige

Effizienz und Leistung

Die neue Pioneer mit vielen Funktionen zum intelligenten Betrieb in Ihrem Labor. Mit antistatischem Stab zur Erdung. Weitere Informationen über die Waagen Pioneer PX

 

mehr...
Anzeige

Newsletter bestellen

Immer auf dem Laufenden mit dem LABO Newsletter

Aktuelle Unternehmensnachrichten, Produktnews und Innovationen kostenfrei in Ihrer Mailbox.

AGB und Datenschutz gelesen und bestätigt.
Zur Startseite