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Liquid-RoboticsDosieren im Pikoliterbereich: Was heute machbar ist

Anwendungen, Dosierungstechnik und Qualitätskontrolle Dr. Holger Eickhoff*)
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Liquid-Robotics: Dosieren im Pikoliterbereich:  Was heute machbar ist

  1. CEO Scienion AG, Dortmund, eickhoff@scienion.de, http://www.scienion.de
Die präzise Dosierung von Pikolitern spielt insbesondere in der Herstellung von Biochips, der Bestückung von Biosensoren oder Lab-On-A-Chip-Substraten sowie bei der Produktion von Point of Care Diagnostik eine zentrale Rolle. Es geht hier um sehr kleine Tröpfchen, aber es ist ein weit verbreiteter Irrglaube, dass man einen Tropfen von einem Millionstel Milliliter nicht sehen kann. Flüssigkeitsmengen von 50 Pikoliter bis zu einem Nanoliter, also einem Millionstel Milliliter, kann man sehr wohl mit dem bloßen Auge erkennen und mit modernen Analysemethoden nicht nur sehen, sondern auch noch gut charakterisieren.

Der Miniaturisierung von Reaktionssystemen wird dort eine wachsende Bedeutung zuteil, wo durch die Verwendung von kleinen Stoffmengen wertvolle Substanzen und Reagenzien gespart werden können. Gelingt es einen Assay zu entwickeln, der 100 Pikoliter anstelle von einem Mikroliter eines bestimmten Reagenz verwendet, können die Kosten dafür um vier Größenordnungen gesenkt werden. Auch bei Berücksichtigung der in den verschiedenen Pikoliter-Handlingsystemen vorhandenen Totvolumina, die einige wenige Mikroliter beinhalten können, bedeutet dies immer noch eine erhebliche Ersparnis. Das konventionelle Beschichten von ELISA-Mikrotiterplatten mit Fänger-Proteinen oder -Antikörpern im Vergleich zur Verwendung einer „gespotteten“ Platte macht hier die Unterschiede sehr deutlich:

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In Standardprotokollen werden etwa 200 Mikroliter einer Lösung von Antigen oder Antikörper-Capturemolekülen eingesetzt (http://www.sigmaaldrich.com/life-science/cell-biology/antibodies/ antibodies-application/protocols/elisa.html#antigen_coating). Die Fängerreagenzien werden typischerweise in einer Konzentration von 1 µg/ml eingesetzt. Der Preis pro Milliliter Coatinglösung beträgt etwa 0,3 Euro, was 0,06 Euro pro Well entspricht. Für eine 96-Well-Platte werden so Coating-Reagenzien im Wert von etwa 6 Euro verbraucht. Im Vergleich dazu bietet eine „gespottete Platte“, bei der einfach anstelle eines flächigen Coatings beispielsweise ein 5 x 5 Array pro Probe eingebracht wird, Vorteile in mehrfacher Hinsicht. Die Kosten werden signikant reduziert, da die abgegebene Menge Reagenz nur 25 x 100 Pikoliter = 2,5 Nanoliter = 0,0025 Mikroliter oder entsprechend der obigen Modellrechnung 0,0000007 Euro/Well (oder weniger als einen Cent pro Platte) beträgt. Als Zugabe erhält man zudem nicht nur einen, sondern 25 Messwerte pro Probe, was eine gute Basis für weitere statistische Analysen darstellen kann.

Die Miniaturisierung der oben beschriebenen ELISA-Assays ermöglicht außerdem die Aufbringung von Verdünnungsreihen in einer einzigen Kavität. So können durch die Variation der abgegebenen Volumen, beispielsweise einem, zwei, vier, zehn und 20 Tropfen pro Spot auch noch Messwerte mit einem erhöhten dynamischen Bereich für einen Analyten erzeugt und ausgewertet werden. Dabei können die verschiedenen Spots darüber hinaus noch aus verschiedenen Fängermolekülen bestehen (Multiplex ELISA), mit der dann theoretisch (aus technischer Sicht) leicht bis zu 144 Analyten parallel bestimmt werden könnten. In der Praxis zeigt sich allerdings, dass die Etablierung solcher Systeme oft mit einem erheblichen Entwicklungsaufwand verbunden ist. Wesentlicher Grund dafür sind Kreuzreaktivitäten der verwendeten Capture- und Detektionsreagenzien, die in einem solchen hochparallelen Multiplexverfahren natürlich schonungslos aufgedeckt werden. Erfahrungen aus der Praxis zeigen aber, dass hier 4 bis 12x Multiplexreaktionen rasch entwickelt werden können.

Zusätzlich kann man in einer gespotteten Platte simultan zur Messung das Hintergrundsignal bestimmen. Dazu wird in aller Regel das Signal zwischen den einzelnen Spots in einer Kavität verwendet. In konventionellen ELISA-Platten wird dagegen für die Messung des Hintergrundsignals eine zusätzliche Plattenkavität benötigt. Werden mehrere Assays in einer Platte durchgeführt, sind dies in aller Regel sogar eine Kavität pro Assay und in der Praxis oft eine komplette Spalte in einer ELISA-Mikroplatte.

Technischer Fortschritt bei der Herstellung von Arrays

Die Technik für die Herstellung dieser Arrays ist dabei in den letzten Jahren weit vorangeschritten. Wurden initial oft Nadeldruckverfahren oder andere Kontaktdruckverfahren für die Herstellung von Arrays mit Antikörpern oder Proteinen als Fängermolekülen eingesetzt, haben sich in diesem Anwendungsbereich mittlerweile kontaktlose Dispensierverfahren weitestgehend durchgesetzt. Die Fängermoleküle können auf diese Weise schonend, reproduzierbar und ohne mechanische Zerstörung auf die Oberflächen der Wahl (Polymer, Glas, Silizium, Metall...) aufgebracht werden. Für den Einsatz der Technik in Forschung und Entwicklung sowie im Produktionsbereich hat Scienion verschiedene Verfahren entwickelt, die den Prozess der Tropfenabgabe und Deposition auf einer Oberfläche sehr genau monitoren und analysieren können.

Der notwendige Volumenbereich pro abgegebenen Tropfen kann dabei durch Variation der angelegten elektrischen Signale fein eingestellt werden. Die Messwerte zeigen, dass die Reproduzierbarkeit der Tropfenabgabe exzellent ist und die Standardabweichungen weniger als 3 % oder weniger als 10 Pikoliter pro 300 Pikoliter Tropfen betragen.

Neben der Online-Bestimmung der Tropfengröße können auch die Tropfengeschwindigkeit und die Abweichung der Tropfenrichtung von einer Ideallinie bestimmt werden. Dafür wird die Dispenserspitze vor eine Kombination von einem Stroboskopblitz und einer CCD-Kamera bewegt. Dann wird etwa 200 µs nach dem Aktorpuls das Blitzlicht angeschaltet und man erhält so mit der Kamera das Bild eines stehenden Tropfens, der sich mit einer Geschwindigkeit zwischen 2,5 bis 3 m/s bewegt. Die Koordinaten dieses Tropfens in Schussrichtung und eine senkrecht dazu mögliche auftretende Ablenkung können so für jeden Tropfen automatisch erfasst werden. Werden diese Koordinaten nach jeder Probenaufnahme automatisch erfasst, ist eine sehr gute Prozesskontrolle möglich: Änderungen in der Probenflüssigkeit (Beispiel: Lösung altert, wird viskoser und der Tropfen langsamer oder verschiedene Batches einer identischen Fängerlösung verhalten sich unterschiedlich) oder Änderungen im Dispensierprozess (Beispiel: Ablagerungen an der Düsenspitze führen zu einer Tropfenablenkung) können sofort detektiert und Gegenmaßnahmen, wie beispielsweise Wasch- und Spülprozesse eingeleitet werden, bevor das System fehlerhafte Produkte produziert.
Ein weiterer Online-Prozesskontrollschritt kann während der Tropfenabgabe auf das Substrat erfolgen. Dies ist durch eine in einem 45° Winkel angebrachte Dispensierkopf-Kamera möglich. Mit einer entsprechenden Optik ausgerüstet, kann so in Real-Time die Tropfenabgabe auf eine Substratoberfläche, beispielsweise Biosensoren oder Biochips, überwacht werden.

Zusammenfassung

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die entwickelten Kontrollmechanismen für den zentralen Prozessschritt in der Aufbringung von teuren biochemischen Reagenzien in der Bestückung von Biochips, Biosensoren, miniaturisierten Testsystemen oder Point of Care Diagnostika eine hervorragende Ausgangsbasis für die Qualitätskontrolle dieser Erzeugnisse bietet. Im Unterschied zu den Methoden, wie sie für konventionelle Liquid-Handling-Systeme angeboten werden wie beispielsweise das Ultrasound Liquid Level Sensing, arbeiten die hier dargestellten Technologien in Echtzeit und erlauben daher gegebenenfalls eine schnelle Intervention und damit verbunden eine signifikante Erhöhung der Produktivität und eine gute Basis für die gestiegenen Anforderungen in der Qualitätskontrolle von modernen Diagnostikprodukten.

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