Micro-Array-Handling

Mykotoxine in Tierfutter

Detektion mit einem Lab-on-a-Chip-System
Bild 1: Vollautomatisches System zur Durchführung von ELISA-Tests bestehend aus Betreibergerät und Einwegpolymer-Kartusche.
Mykotoxine sind gesundheitsschädliche Metaboliten saprophytischer Pilzarten, die unter geeigneten Umgebungsbedingungen auf kohlenhydratreichen Pflanzenteilen wie beispielweise Getreide oder Nüssen wachsen können. In die Nahrungskette des Menschen gelangen diese schädlichen Substanzen durch den Verzehr von kontaminierten pflanzlichen, aber auch tierischen Nahrungsmitteln wie Fleisch und Milch.

Fleisch und Milch enthalten in der Regel Metaboliten von Mykotoxinen, die im tierischen Organismus durch die Aufnahme von belasteten Futtermitteln entstehen können. Als Beispiel ist hier das in Milch auftretende Aflatoxin M1 zu nennen, das aus in pflanzlichen Futtermitteln enthaltenem Aflatoxin B1 gebildet wird. Ein Großteil der Mykotoxine ist krebserregend, genotoxisch oder greift Leber und Nieren an und stellt somit ein hohes Risiko für die Gesundheit des Menschen dar. Es ist inzwischen eine wissenschaftlich allgemein anerkannte Erkenntnis, dass durch Mykotoxine hervorgerufene akute Krankheiten (Mykotoxikosen) für mehrere größere Epidemien unter Menschen sowie Tieren verantwortlich waren [1].

Da es sich bei Mykotoxinen um robuste, kleine Moleküle handelt, lassen sich diese nicht durch die haushaltsüblichen Methoden der Nahrungszubereitung wie Fermentation, Temperatureinwirkungen während des Kochens, Backens oder des Gefriervorgangs zerstören. Nur eine vollständige Vermeidung von kontaminierten Futter- und Nahrungsmitteln bietet ausreichendend Schutz für Mensch und Tier. Erschwerend kommt hinzu, dass sich Mykotoxine durch visuelle Screening-Methoden nicht zuverlässig nachweisen lassen, weil nach Entfernen bzw. Zersetzung des verursachenden, in der Regel gut sichtbaren Pilzkörpers durchaus große Mengen an Mykotoxin zurückbleiben können. Zum Schutz der Gesundheit ist daher die Verfügbarkeit von ausreichend empfindlichen und bezahlbaren Schnelltests zur Detektion und Quantifizierung von Mykotoxinen von hohem Interesse.

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Eine viel genutzte Möglichkeit zur Detektion bestimmter Substanzen stellen immunologische Verfahren wie beispielsweise ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) dar. Das ELISA-Nachweisverfahren, das über die hohe Spezifität der Anbindung von Antikörpern an Antigene arbeitet, wird gerne für den relativ kostengünstigen und schnellen Nachweis von Substanzen wie Toxine und Antibiotika in Proben wie z.B. Getreide oder Fleisch eingesetzt. Anders als qualitative bzw. semiquantitative immunologische Verfahren, die auf Teststreifen ablaufen, erfordert die Durchführung eines quantitativen ELISA jedoch den Einsatz einer gut ausgebildeten Laborfachkraft, die den Test im Allgemeinen in einem Zentrallabor ausführt. In vielen Fällen, wie beispielsweise beim Mykotoxintest, ist es jedoch wünschenswert, das Ergebnis ohne große Zeitverzögerung direkt vor Ort, z.B. beim Nahrungs- bzw. Futtermittelhersteller, zu erhalten. Für diesen Zweck würden sich kostengünstige kompakte Geräte eignen, die durch vollautomatische Führung des Analyseprozesses, beispielsweise in einem Lab-on-a-Chip-System, auch von wenig geschultem Personal bedient werden könnten. Durch Verwendung von Einwegkartuschen, die jeweils nur für eine Analyse zum Einsatz kommen, sowie die Durchführung des Tests in einem vollautomatisierten, abgeschlossenen System werden zusätzlich Fehler durch Eintrag von Verunreinigungen vermieden.

Am Institut für Mikrotechnik Mainz wurde im Rahmen des EU-Projekts microFLUID ein chipbasiertes mikrofluidisches System entwickelt, das mittels optischer Detektion der Ergebnisse eines integrierten ELISA-Tests einen verlässlichen und quantitativen Nachweis von Mykotoxinen in Tierfutter ermöglichen soll. Es stellt eine von mehreren Anwendungen dar, an denen im Rahmen des Projektes microFLUID im Themenbereich Umweltanalytik gearbeitet wurde [2, 3]. Das vollautomatische System mit integriertem Schneidmahlwerk ermöglicht die direkte Verarbeitung von Rohmaterial wie Mais, Körnern oder Pellets. Der Einsatz mikrofluidischer Analysetechnik erleichtert die Miniaturisierung des Systems, so dass nur geringe Mengen an Reagenzien für die Probenuntersuchung verwendet werden müssen. Dies senkt die Kosten und – noch wichtiger – es vermeidet die Handhabung von großen Mengen an Toxinen.
Dank der Portabilität und Automatisierung des Systems lassen sich Analysen direkt vor Ort durchführen, und zwar auch von minimal geschultem Personal. Mit einem solchen System können nicht nur Zeit und Kosten gespart, sondern auch eine signifikante Verbesserung bei der Prävention und Kontrolle der Kontamination mit Mykotoxinen erreicht werden.

ELISA im Lab-on-a-Chip

Das hier vorgestellte mikrofluidische Lab-on-a-Chip-Gerät kann durch die vollautomatische Führung von nur wenig geschultem Personal bedient werde. Es besteht aus einem Betreibersystem und einem passenden Einwegpolymerchip zum Prozessieren der Probe sowie zur Lagerung von lyophilisierten, d.h. getrockneten Reagenzien. Darüber hinaus ermöglich ein in das mikrofluidische Netzwerk integriertes Extraktionsmodul mit Schneidmahlwerk die direkte Verarbeitung von festen Proben wie beispielsweise Futtermittel. Das Hauptgerät hingegen stellt alle Elemente zur fluidischen und mechanischen Aktorik sowie Module zur optischen Detektion zur Verfügung.

Das Gerät ist grundsätzlich nicht nur zum Mykotoxinnachweis, sondern allgemein für einen bestimmten Typ immunologischer Testabläufe ausgelegt, der mit immobilisierten Fängermolekülen in einer optischen Messzelle arbeitet. In dieser binden im Verlauf des Tests enzymgekoppelte Antikörper, an denen im letzten Schritt ein fluorogenes Substrat umgesetzt wird. Die Detektion erfolgt durch eine relativ preisgünstige und kompakte Optik aus LEDs und Photo-dioden.

Der Einwegchip, einschließlich der Extraktionskammer, ist so konstruiert, dass er mit kosteneffizienten Massenfertigungstechniken wie Spritzguss kompatibel ist. Zur Quantifizierung der Analysenergebnisse wurde das Gerät mit kompakten sowie kostengünstigen Modulen zur Auslesung von optischen Signalen ausgestattet, die im Gerät jeweils unter dem Detektionskanal der Einwegkartusche platziert wurden.

Der jeweilige ELISA-Test findet auf der Einwegkartusche aus spritzgussfähigen Thermoplasten statt. Alle Schritte eines typischen ELISA-Protokolls, inklusive Dosierung von Reagenzien und Waschen, werden dabei direkt auf den vollautomatischen Ablauf im mikro- fluidischen System abgebildet. Im Ablauf zum Nachweis von Mykotoxinen wurde ein Protokoll implementiert, das mit immobilisierten Antigenen im Detektionskanal arbeitet. Ein Konjugat aus passenden Antikörpern mit Enzymen kann auf dem Polymerchip in getrocknetem (lyophilisierten) Zustand gelagert werden. Der nötige Waschpuffer zur Entfernung von überschüssigen Konjugaten aus der Detektionskammer wird hingegen in aufsteckbaren Containern zur Verfügung gestellt.

Ein typisches Design der ELISA-Kartusche am Beispiel eines Tests zum Nachweis von Aflatoxin B1 ist in den Bildern 2 und 3 wiedergegeben.

Integriertes Proben- vorbereitungsmodul

Um tatsächlich einen vollautomatischen Ablauf der Analyse zu gewährleisten, wurde speziell für den Nachweis von Mykotoxinen in Futtermitteln ein Probenvorbereitungsmodul integriert, das sowohl dazu in der Lage ist, feste Futterproben zu Zerkleinern als auch nach Zuführung des Extraktionsmittels über einen internen Kanal die Probe zu homogenisieren und den in Lösung gebrachten Analyten zu extrahieren (vgl. Bild 4). Schwebeteilchen werden über ein mehrschichtiges Filtermodul unterhalb der Extraktionskammer abgetrennt. Durch geeignete Auswahl von Porengröße und Oberflächeneigenschaften (z.B. Hydrophobizität) des Filtermaterials besteht die Möglichkeit, auch ohne zusätzliches Ventil eine ausreichende Standzeit der Lösung oberhalb des Filters sicherzustellen. Im Fall von 70 % Methanol in Wasser als Extraktionsmittel reichte eine PVDF-Membran (Firma Millipore, MA, USA) mit einer Porengröße von 0,45 µm aus, um die Extraktionsmischung ca. 9 min in der Kammer zu halten.

Während alle Bereiche, die mit potenziell kontaminierten Flüssigkeiten bzw. Reagenzien in Kontakt kommen können, in der Einwegkartusche untergebracht wurden, nimmt das Betreibergerät die Module auf, die wiederverwendbar sind. Dazu gehören die optischen Module, die mechanische Aktorik zum Betreiben des Schneidmessers in der Extraktionseinheit, die Aktorik zur Manipulation der fluidischen Abläufe sowie Lichtschranken zur zweifelsfreien Bestimmung der Position eines bewegten Fluidvolumens während der Durchführung des Assays.

Mikro-Schlauchpumpe und Miniatur-Drehventile

Zum Druckaufbau bzw. zum Durchsaugen von Flüssigkeiten durch den Extraktor bzw. Detektionschip wurde eine käuflich erwerbliche Mikro-Schlauchpumpe eingesetzt. Diese fördert im Verlauf des Assays ausschließlich Luft, kommt also nicht mit Flüssigkeiten in Berührung.

Zwei auf dem Chip integrierte Mehrwege-Drehventile ermöglichen den Transport der jeweiligen Fluidvolumina über eindeutig festlegbare Wege durch den Chip. Bei der Auswahl geeigneter Ventilpositionen wurde darauf geachtet, Kreuzkontaminationen zwischen den Kanälen zu vermeiden.

Zur Bestimmung der Volumina von Analyt bzw. wieder in Lösung gebrachten Konjugaten dienen auf der Einweg-Kartusche untergebrachte Messstrecken zwischen den Ventilen und Lichtschranken.

Nach Implementierung eines ELISA-Tests mit Peroxidase-markierten monoklonalen Antikörpern gegen Aflatoxin B1 und fluorogenem Substrat war das hier beschriebene Polymerchip-basierte Analysensystem in der Lage, Aflatoxin B1 in dem für die Qualitätskontrolle von Futtermitteln relevanten Konzentrationsbereich von ca. 2...50 nM quantitativ nachzuweisen. Die Wiederfindungsrate für Myko-toxine war jeweils höher als 80 %.

Fazit und Ausblick

Es wurde ein System zur vollautomatischen und kontaminationsfreien Durchführung von ELISA-Tests auf einem kompakten System mit Einweg-Kartuschen entwickelt. Durch Integration der Probenaufbereitung sind in diesem System keine zusätzlichen Analysenschritte in externen Modulen wie beispielsweise Extraktoren oder Mühlen notwendig.

Die im hier entwickelten Gerät eingesetzte Technik mit Positionierung von Reaktionsvolumina im Fluidnetzwerk durch Lichtschranken und Mehrwegeventile ermöglicht eine Übertragung konventioneller ELISA-Tests auf ein Lab-on-a-Chip-System.

Die prinzipielle Technologie der hier getesteten Aflatoxin-B1-Anwendung bietet das Potential, auf andere Anwendungen wie z.B. Allergentests in Nahrungsmitteln oder Toxinnachweis in Meeresfrüchten erweitert zu werden.

Da bereits in der Entwicklungsphase des Gerätes Massenfertigungsaspekte berücksichtigt wurden, u.a. auch bei der Auswahl eines geeigneten Polymermaterials, lässt sich die Technologie nahezu nahtlos in die Massenfertigung übertragen.

Literatur

  1. Yiannikouris, A., Jouany, J.-P., Anim. Res. 51 (2002), 81-99.
  2. http://www.imm-mainz.de/982.htm.
  3. http://www.ifn.cnr.it/microfluid.
  4. I. Frese, E. Narstedt, K. S. Drese, Measurement Chip, US2009161108 (2009-06-25).
  5. Brunklaus, S.; Stein, V.; Jakubowski, M.; Welzel, K.; Frese, I.; Ritzi-Lehnert, M.; Drese, K., Proceedings Mikrosystemtechnik Kongress 2011, 10.-12. Oktober 2011 in Darmstadt, VDE-Verlag, Berlin, 2011, 449-452.
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