Mikroplastik analysieren mit automatisierter Raman-Mikrospektroskopie

Partikel-Identifizierung in Trinkwasser

Analysenverfahren sollten möglichst einfach, schnell und kostengünstig, aber auch verlässlich und genau sein. Dass sich diese Ansprüche nicht immer umsetzen lassen, wissen alle Analytiker, die sich mit Mikroplastik beschäftigen.

Bild 1: Schematischer Aufbau des SPE. Alle Bilder mit freundlicher Genehmigung von rap.ID Particle Systems.

Da es sich bei Mikroplastik um eine relativ junge Kontaminante handelt, sind die Untersuchungsverfahren noch nicht ausgereift. Es gibt bisher keinen universellen „Mikroplastik-Analysator“ mit dem man alle Mikroplastik-Parameter auf einmal ermitteln kann. Vielmehr muss auf verschiedene Verfahren gesetzt werden, um alle Informationen aus den Proben zu extrahieren.

Doch welche Parameter sind überhaupt wichtig? Zum einen ist die Zusammensetzung der Polymere von großer Bedeutung. Aber auch die Masse der kleinen Plastikbruchstücke ist ein wichtiger Faktor. Außerdem sind die Größe, Morphologie und die schiere Anzahl der Teilchen – vor allem für die toxikologische Bewertung – wichtig [1].

Abhängig vom untersuchten Medium (von Umweltproben wie Meerwasser oder Sedimentproben über marine Spezies bis zu Wasser- und Lebensmittelproben) werden verschiedenste Probennahme-, Aufarbeitungs- und Analysenmethoden eingesetzt [2]. Eine Harmonisierung oder einheitliche Verfahrensweise hat sich noch nicht etabliert.

Bild 2: Arbeitsablauf.

Um die Masse und Zusammensetzung der in der Probe enthaltenen Kunststoffe zu bestimmen, werden hauptsächlich thermoanalytische Methoden eingesetzt. Vielversprechend ist die quantitative Bestimmung in Umweltmatrices mittels TED-GC-MS (Thermische Extraktion Desorption GC-MS) [3]. Da bei thermoanalytischen Methoden die Polymere zersetzt werden, ist keine Aussage über die Anzahl und Größe der Partikel möglich.

Anzeige

Um Aussagen über die Größe, Morphologie und Anzahl der Teilchen zu bekommen, werden vor allem visuelle und Färbemethoden mit und ohne Mikroskop eingesetzt. Diese sind zwar kostengünstig und einfach, doch auch ungenau und fehleranfällig [4]. Genauer und sicherer fährt man mit der spektroskopischen Bestimmung der Partikel, da hier anhand charakteristischer Spektren auf die Natur der Partikel geschlossen werden kann. Ist diese mit einem Mikroskop gekoppelt spricht man von der Mikro-Spektroskopie (µ-Spektroskopie). Hier kommen FT-IR- oder Raman-Spektroskopie zum Einsatz. Mit letzterer können Partikelgrößen bis 1 µm analysiert werden, wobei die FT-IR-µ-Spektroskopie nur Partikelgrößen bis 20 µm analysieren kann [5].

Bild 3: filtr.AID© Goldfilter.

Das hier vorgestellte µ-Ramanspektroskop von rap.ID Particle Systems wurde bisher hauptsächlich in der pharmazeutischen Analytik eingesetzt, um z.B. die Reinheit von Infusionslösungen oder die Partikelverteilung von Asthmasprays zu bestimmen. Warum sich damit u.a. auch Mikroplastikpartikel in Mineralwasser analysieren lassen, sollen die folgenden Seiten zeigen.

SPE: Aufbau und Arbeitsweise
Der SPE (Single Particle Explorer) ist ein Mikroskop mit bis zu fünf Objektiven (5x, 10x, 20x, 50x Vergrößerung, jeweils ein für Raman bzw. LIBS optimiertes Objektiv), einem integrierten Raman-Spektrometer und einer Farbkamera. Optional kann ein Spektrometer zur Elementaranalyse eingebaut werden (Bild 1). In Bild 2 ist die Arbeitsweise verkürzt dargestellt: Die Probe wird filtriert und der Filter fest im SPE eingespannt. Dann erfolgt die Bildanalyse, mit welcher die Partikel erkannt werden, um schließlich mit dem Raman-Laser analysiert zu werden. Nach erfolgtem Datenbankabgleich sind die Ergebnisse abrufbar. Nachfolgend werden die einzelnen Schritte genauer erläutert.

Bild 4: Trichter mit 18 mm und 4 mm Innendurchmesser.

Probenvorbereitung
Zuerst müssen die Partikel durch Filtration vom Medium abgetrennt werden. Gegebenenfalls erfolgt eine vorherige Aufkonzentrierung durch Dichtetrennung und/oder Entfernung von anderen Bestandteilen durch z.B. Oxidation o.ä.

Da Gold nur einen sehr geringen Ramanhintergrund beiträgt, kann ein schärferer Kontrast zwischen Partikel und Hintergrund hergestellt werden, indem goldbeschichtete Polycarbonat-Filter (patentierte filtr.AID©Technologie) für die Filtration verwendet werden. Diese sind in den folgenden Porengrößen erhältlich: 0,8 µm, 3 µm und 10 µm.

Bild 5: Schematische Darstellung der Dunkelfeldbeleuchtung.

Durch spezielle hochpolierte Trichter ist ein dichter Abschluss von Trichter, Filter und Fritte gewährleistet. Die Trichter sind in verschiedenen Innendurchmessern erhältlich, so dass man mit der Fläche der Filtration einen Einfluss auf die Filtrier-, aber auch Messgeschwindigkeit ausüben kann. Ist es eine klare Flüssigkeit, die sehr wenig Partikel enthält, empfiehlt es sich, die kleinste Filtrationsfläche von 4 mm auszuwählen, um eine kürzere Dauer der Bildererkennung (Image-Analysis) zu erreichen. Sind viele Partikel enthalten, muss auf eine größere Filtrationsfläche ausgewichen werden, um ein Zusetzen oder Überladen des Filters zu vermeiden oder die Probe muss verdünnt werden.

Durch das Einspannen des beladenen Filters in den Probenteller entsteht eine glatte Oberfläche, die für die Dunkelfeld-Mikroskopie von großer Bedeutung ist. Denn bei dieser Mikroskopie wird Licht nicht von oben, sondern von der Seite auf die Partikel gestrahlt. Die Partikel, die aus der Ebene herausragen, leuchten damit hell und der Hintergrund wird ausgeblendet und erscheint dunkel (siehe Bild 5).

Bild 6a: Filterausschnitt im Hellfeld.

Selbst kleinste transparente Partikel werden sichtbar, die mit dem Auflicht der normalen Hellfeld-Mikroskopie übersehen werden könnten. Zur Veranschaulichung ist in Bild 6 (nächste Seite) eine Aufnahme des Goldfilters im Hellfeld dargestellt; die gleichmäßig verteilten Punkte sind die Poren, daneben ist dasselbe Bild im Dunkelfeld abgebildet, hier sind nur noch die Partikel sichtbar.

Bild für Bild mit automatisierter Mikroskopie – Bildaufnahme
Um die bestmöglichen Aufnahmen für die automatisierte Partikelerkennung zu erhalten, sind die Kamera- und Belichtungsparameter so einzustellen, dass die Partikel für die anschließende Binarisierung (s.u.) gut erkennbar, nicht über-, aber auch nicht unterbelichtet sind, um einen optimalen Wert für den Kontrast zwischen Filterhintergrund und Partikel zu erreichen. Sind die geeigneten Parameter gefunden, können sie gespeichert werden.

Danach legt der Anwender den zu analysierenden Bereich fest: Möchte man die komplette Filtrationsfläche abbilden, um kein Partikel auszulassen, oder nur einen Ausschnitt des Filters?

Bild 6b: Filterausschnitt im Dunkelfeld.

Entsprechend dieser Einstellungen erfolgt dann die Bildaufnahme (Image Analysis) – Bild für Bild wird fotografiert, bis der komplette ausgewählte Bereich dargestellt ist. Jedes einzelne Bild wird binarisiert, wobei aus dem Graustufenbild, das die Kamera fotografiert hat, ein binäres Bild wird, das nur noch aus schwarzen und weißen Pixeln besteht. Entsprechend des eingestellten Schwellenwerts werden so die Bereiche getrennt, die als Partikel (schwarz) oder Filteroberfläche (weiß) interpretiert werden (s. Bild 7).

Es ist auch möglich, die Einstellung „Autofocus on each particle“ auszuwählen. Hierbei wird jedes zu analysierende Partikel vor der Analyse nochmal automatisch mit dem Objektiv fokussiert. Nachteilig dabei ist jedoch, dass sich die Analysezeit dadurch deutlich verlängert. Zum Verhindern von Glanz- effekten kann außerdem ein Polfilter eingefahren werden.

Der 4-fache Probenhalter ermöglicht es, mehrere Filter nacheinander (z.B. übers Wochenende) zu messen. Allerdings ist dann die nachträgliche Von-Hand-Auswertung nicht mehr möglich.

Bild 7: Vor der Binarisierung (links), nach der Binarisierung (rechts).

Partikel-Analyse
Für die optisch ermittelten Partikel können bis zu zehn Größenklassen vom Anwender festgelegt werden. Alle bei der Bildanalyse erkannten Partikel werden entsprechend ihrer Länge in die entsprechende Größenklasse erfasst und im Report ausgegeben.

Jedes Partikel wird mit seinen Koordinaten zusammen gespeichert. Partikel, die mehrere Felder überlappen, werden zusammengefügt. Der Anwender kann festlegen, ob und wieviele hochauflösende Fotos zusätzlich mit der Kamera gemacht werden sollen.

Ziel-Partikel Auswahl für die Raman-Spektroskopie
Alle oder ein Teil der erfassten Partikel können im Anschluss mit dem Raman-Laser beschossen werden. Der Anwender hat die Wahl, einen Laser im grünen (532 nm) oder roten (785 nm) Bereich auszuwählen; es ist auch möglich, beide Laser nacheinander anzuwenden. Beschussintensität und -dauer werden zuvor eingestellt. Es besteht zudem die Möglichkeit, Fluoreszenzen mittels „preburning“ auszubleichen.

Bild 8: Auszug Reportausgabe.

Der Anwender kann entweder nur einen bestimmten Größenbereich im Zufallsmodus analysieren oder von einem Größenbereich die z.B. 100 größten Partikel zur Spektroskopie auswählen. Außerdem können Partikel spezifisch über weitere Formparameter wie die Elongation, Fasrigkeit oder Rundheit für die Analyse ausgewählt werden.

Es können maximal 5 000 Partikel pro Messung mit dem Raman-Laser gemessen werden. Diesen limitierenden Faktor kann man teilweise umgehen, indem eine Probe mehrmals gemessen wird und dabei die zu analysierenden Größenbereiche verändert werden. Eine Messung mit 5 000 Partikeln dauert bei einem Beschuss von 10 s ca. 18 h.

Möchte der Anwender neben der Raman-Spektroskopie eine Elementaranalyse durchführen, kann die LIBS-Spektroskopie (Laser Induced Breakdown Spectroscopy) integriert werden. Erwähnenswert für z.B. Färbemethoden wie die Nilrot-Methode ist außerdem die Fluoreszenz-Option des Gerätes.

Von-Hand-Auswertung nachträglich möglich
Nachdem alle Partikel analysiert wurden und die automatische Messung abgeschlossen ist, kann der Anwender im Live-Modus relevante Partikel anfahren und ggf. mit veränderter Intensität und Dauer beschießen und neue Spektren aufnehmen. Auch Fotos können nachträglich gemacht werden.

Die Ergebnisse werden als Reportdatei gespeichert. Alle Informationen der Messung sind darin enthalten. Am Ende des Reports sind die Partikel entsprechend ihrer Größeneinteilung und der zugeordneten Identität in einer Tabelle zusammengefasst (Bsp. s. Bild 8). Die Tabelle lässt sich gut z.B. in eine Excel-Tabelle kopieren. Die Dateien können allerdings je nach Messumfang sehr groß werden, ausreichender Speicherplatz ist hier hilfreich.

Im Lieferumfang des Gerätes sind verschiedene Standards enthalten, um Kalibrationen durchzuführen und die Verlässlichkeit des Systems überprüfen und dokumentieren zu können.

Fazit
Die Identifizierung, Zählung, Größe und Morphologie-Analyse von Partikeln kann durch die automatisierte µ-Spektroskopie von rap.ID vereinfacht erfolgen und liefert durch die hohe Anzahl spektroskopisch analysierbarer Partikel besonders aussagekräftige Ergebnisse im Bereich bis zu 1 µm, womit sich bisher nur die µ-Raman-Spektroskopie rühmen kann. Diese Empfindlichkeit bedingt jedoch, dass Proben, sofern sie sich nicht um partikelarmes Wasser handeln, derart aufgearbeitet werden müssen, dass bei der Filtration kein Film auf dem Goldfilter entsteht oder sich gar der Filter zusetzt. Bei der Mikroplastik-Analytik ist außerdem ein Arbeiten unter Reinstraumbedingungen Voraussetzung, um Kontaminationen von außen zu vermeiden – insbesondere dann, wenn es um Partikel im unteren Mikrometerbereich geht. – Die eingangs erwähnten Ansprüche an ein schnelles und kostengünstiges Analysenverfahren kann man zwar bei dem hier vorgestellten Verfahren diskutieren, Arbeitserleichterung durch die Automatisierung, Verlässlichkeit und Genauigkeit stehen jedoch außer Frage.

Literatur/ Referenzen
Rap.ID SPE Benutzerhandbuch, SPE V 3.7, rapID Particle Systems GmbH, 2014.
[1] EFSA Panel on Contaminants in the Food Chain (EFSA CONTAM Panel), EFSA Journal 2016, 14, e04501-n/a.
[2] a) V. Hidalgo-Ruz, L. Gutow, R. C. Thompson, M. Thiel, Environ. Sci. Technol. 2012, 46, 3060; b)D. Miklos, N. Obermaier, M. Jekel, “Mikroplastik: Entwicklung eines Umweltbewertungskonzepts.Erste Überlegungen zur Re Relevanz von synthetischen Polymeren in der Umwelt”, zu finden unter http://www.umweltbundesamt.de/publikationen/mikroplastik-entwicklung-eines, 2016.
[3] E. Dümichen, A.-K. Barthel, U. Braun, C. G. Bannick, K. Brand, M. Jekel, R. Senz, Water research 2015, 85, 451.
[4] Y. K. Song, S. H. Hong, M. Jang, G. M. Han, M. Rani, J. Lee, W. J. Shim, Marine Pollution Bulletin 2015, 93, 202.
[5] N. P. Ivleva, R. Nießner, Nachr. Chem. 2015, 63, 46.

AUTORIN
Darena Schymanski
Chemisches und Veterinäruntersuchungsamt Münsterland-Emscher-Lippe (CVUA-MEL) - AöR, Münster

Anzeige

Das könnte Sie auch interessieren

Anzeige
Anzeige

Für Prozess- und Umweltkontrolle

Gas-Sensoren

Die NDIR-Sensoren der Serien SmartModulFlow und SmartModulPremium detektieren selbst geringste Konzentrationen einer Vielzahl an Gasen und lassen sich dank ihrer kompakten Bauform in alle Arten von Analysengeräten integrieren. 

mehr...

LIMS für Umweltlabore

Keine Angst vor Komplexität

Um Umweltlaboren den Einstieg in ein Labor-Informations- und Management-System zu erleichtern, haben die Entwickler des IT-Unternehmens dialog EDV Systementwicklung ihre langjährigen Erfahrungen speziell mit Umweltprojekten in ein neues LIMS...

mehr...