Fachbeitrag

Akustooptik im Dienste der „Microplate-Technology“

Perspektiven der akustooptischen ­Spektralphotometrie
Dr. B. Gurath*), L. Pfeifer**), D. Nicklaus***) und C. Baumann****)
Eine einfache „Milchmädchen-Rechnung” demonstriert die Grenzen der Spektralphotometrie in der „Microplate Technology”, speziell bei den Massenuntersuchungen. Will man zum Beispiel in einem Spektralbereich von 250...750 nm mit einer Auflösung von 1nm ein vollständiges 3D-Fluoreszenzspektrum aufnehmen, dann entsteht ein Spektralgebirge von 501 × 501 nm. Da jede Änderung der Wellenlänge an die mechanische Bewegung des Beugungsgitters gebunden ist, würde das Analyt bereits verdunsten, bevor die Messung zu Ende geführt wird.

J. von Fraunhofer und H. A. Rowland haben mit dem ersten geritzten Beugungsgitter entscheidende Impulse für die Konstruktion von Spektralapparaten gegeben, jedoch blieb das grundlegende mechanische Prinzip des Monochromators seit 1883 unverändert. Es wird ein sehr schnell durchstimmbarer Monochromator benötigt! Den Lösungsansatz bietet die Akustooptik:

Anstelle des klassischen zweidimensionalen Reflexionsgitters verwende man als dispersives Element ein Transmissions-Volumengitter, einen akustooptischen Filter (AOTF). Dieser Filter lässt sich mit elektronischer Geschwindigkeit durchstimmen. Es können Scangeschwindigkeiten bis zu 500 nm/ms erreicht werden.

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Der AOTF

Ein Beugungsgitter von großer Regelmäßigkeit stellt eine Ultraschallwelle dar, wenn sie sich in einem festen Körper ausbreitet. Eine Schallwelle besteht aus einer regelmäßigen Aufeinanderfolge von Kompressionen und Depressionen, wobei der Abstand dieser Perioden durch die Schallwellenlänge Λ gegeben ist. Läuft durch ein transparentes Medium (mit der Brechzahl n) eine Schallwelle durch, dann wird der atomare Gitterabstand des Kristalls variiert und demzufolge auch die Brechzahl: n + Δn, n – Δn. Es entsteht dadurch ein Material – ein Volumengitter - mit periodischer Struktur, das auf die Phase von Lichtwellen wirkt, ein Phasengitter. Dieses Volumengitter besteht demnach aus einer örtlichen periodischen Modulation der Brechzahl n.

Die Beugung an dünnen Gittern kann mit beliebiger Einfallsrichtung erfolgen und es treten mehrere Beugungsordnungen auf. Bei Beugung am dicken Gitter tritt nur eine Beugungsordnung auf, nun ist jedoch der Einfallswinkel (αi) nicht mehr beliebig, sondern muss gleich dem halben Beugungswinkel bzw. Bragg-Winkel sein. Die auf Grund der konstruktiven Interferenz auftretende Beugung 1. Ordnung hat eine starke Intensität und zeigt einen Beugungswirkungsgrad von Annähernd 100 % im Vergleich zu der maximal möglichen 34 % bei den dünnen Gittern.

Unter Betrachtung der Richtung des zu beugenden Lichtstrahls und der Laufrichtung des Ultraschalls werden 2 optische Konstruktionen unterschieden, collineare und nicht-collineare AOTF.

Im collinearen Modus laufen in dem Kristall die akustische mit der optischen Welle parallel (Bild 1) [1]. In diesem Fall muss der gebeugte Strahl durch Benutzung zweier gekreuzter Polarisatoren separiert werden. Da die Wirkungslänge zwischen akustischer Welle und einfallendem Lichtstrahl relativ groß ist, (beispielsweise 100 mm Quarzkristall des akustooptischen Spektrometers „AOS µCHRON 4” der IFU GmbH [4]), besitzt diese Konstruktion eine hohe spektrale Auflösung (beispielsweise 0,05 nm @ 253 nm). Collineare AOTFs werden am häufigsten aus Quarzkristall hergestellt. Für Quarz muss eine relativ große akustische Leistung (bis zu 20 W) verwendet werden.

Bild 1

In dem nicht-collinearen Modus läuft im Kristall die akustische Welle orthogonal zu der optischen Welle (Bild 2) [7]. Gebeugtes Licht (± 1. Ordnung) und ungebeugtes Licht (0. Ordnung) treten mit unterschiedlichen Winkeln aus dem Kristall. Dieser Divergenzwinkel ist materialabhängig und beträgt bei Paratellurit ca. 6º, bei Quarz 4º. Die +1. und die -1. Ordnungen sind zueinander orthogonal polarisiert und bilden den „O” ordinary und den „E” extraordinary Lichtstrahl.

Bild 2

Der Aufbau

Die Ultraschallwelle erzeugt das gewünschte (Phasen-)Volumengitter. Die Ultraschallwelle selbst entsteht mit Hilfe eines Piezotransducers (meist LiNbO3-Kristall), welcher von dem RF-Generator (Radio Frequency) angesteuert wird, d. h. die elektrische Frequenz wird in die akustische Frequenz (fa) umgewandelt. Um die akustischen Schwingungen verlustarm in den Kristall einzukoppeln, werden Piezotransducer und AOTF-Kristal diffusionsverschweißt. Weiterhin muss konstruktiv dafür Sorge getragen werden, dass durch den Kristall laufende Schallwellen an der Rückwand absorbiert werden. Eine Reflektion oder möglicherweise die Bildung einer stehenden Welle würde die spektrale Auflösung unkontrolliert beeinflussen [5]. Die Impedanzanpassung und Energieübertragung: RF-Generator – Piezotransducer – AOTF-Kristall ist eine verfahrenstechnische Herausforderung!

Collinear oder nicht-collinear?

Der collineare AOTF zeichnet sich durch die schmale spektrale Bandbreite, durch die große Apertur sowie durch einen geringeren Wirkungsgrad aus. Demnach wird diese Konstruktion für die schnelle Analyse von Emissionsspektren und für die Spektroskopie von Bildern eingesetzt [ 4,12]. Der nicht-collineare AOTF ist breitbandiger und hat theoretisch einen annähernd 100%igen Wirkungsgrad. Demnach kann diese Konstruktion allgemein für die Spektralphotometrie von wässrigen Lösungen eingesetzt werden: Als mono- oder polychromatische Lichtquelle für die Absorptionsphotometrie und als Anregungsquelle für die Fluoreszenzphotometrie oder als Mono- oder Polychromator für die Detektion des emittierten Fluoreszenzlichtes.

Betriebsdaten des nicht-collinearen AOTF

Die Intensitätsverteilung eines ausgewählten Spektralbandes verläuft nach der Spaltfunktion. Die unerwünschten Nebenkeulen lassen sich bei sorgfältiger Konstruktion Minimieren [16]. Die spektrale Auflösung R (Resolution) ist von der Wirkungslänge (L) des doppelbrechenden Kristalls (ne, no) und von der Länge der akustische Welle (Λ) abhängig:

R = λ0/Λλ = L/Λ.

Die spektrale Halbwertsbreite Δλ (FWHM) ist ebenfalls wellenlängenabhängig:

Δλ = 8 πλ²/ b L sin²αi

mit αi als Winkel zwischen dem einfallenden ­(incidence) Strahl und der [001]-Achse des Kristalls und b als (dispersivem) Faktor. Ein errechneter Verlauf ist in der Bild 3 dargestellt.

Bild 3

In der ersten Näherung ist die zentrale Wellenlänge (λ0) im Bandpass gegeben durch:

λ0 = Va Δn ( sin4 αi + sin2 2 αi )1/2 /fa

mit Δn = ¦ne – no¦, Va als Ausbreitungsgeschwindigkeit der akustischen Welle im Kristall (beispielsweise 617 m/s bei Paratellurit und 3600 m/s bei Quarz) und akustische Frequenz fa (beispielsweise in einer Größenordnung von 50...200 MHz).

Die experimentell ermittelte Kalibrierungskurve λ0, fa zweier identischer Konstruktionen ist in Bild 4 dargestellt. Da Paratellurit doppelbrechend ist, gilt diese Kalibrierkurve streng nur für die eine Polarisationsrichtung.

Weil Δn ungleich Null ist, gehören zu einer gegebenen akustischen Frequenz 2 unterschiedliche optische Wellenlängen: λ0ο für den ordentlichen und λ0e für den außerordentlichen Strahl. Die Differenz beträgt beispielsweise bei Paratellurit bei λ0 = 500 nm; Δn = 0,15. Demnach müssen λ0o und λ0e sich unterscheiden!

Mit einem experimentalen Aufbau wurde dieses interessante Phänomen demonstriert. Den Beweis: λ0o-- λ0e = 5 nm erbringen die Spektren (Bild 5...8). Die Spektren wurden mit an einem Czerny-Turner-Polychromator angeschlossenen CCD-Specbos der Fa. JETI aus Jena aufgenommen. Die Akustooptik, wie Xenon-Lichtquelle, AOTF-(TeO2-)Monochromator einschließlich Ansteuerung und Datenauswertung bildet das Exitationsmodul des μFAOS (Fluorescence-Acousto-Optical-Spectrometer), eine Gemeinschaftsentwicklung der Autoren.

Das ungebeugte Spektrum der Lichtquelle, d.h. ohne aufgeprägte akustische Leistung (Pa), ist auf Bild 5 dargestellt. Das Einschalten der akustischen Welle und die Einstellung auf fa = 144,867558 MHz entspricht einer gebeugten Wellenlänge λ0o = 500 nm wie auf dem Spektrum der +1. Beugungsordnung im Bild 7 zu ersehen ist. Bei der gleichen Einstellung des RF-Generators können wir für die –1. Beugungsordnung eine Verschiebung von ca. 5 nm, λ0e = 505 nm beobachten (Bild 8). Demnach müssten aus dem Spektrum der 0. Beugungsordnung sowohl die Wellenlängen 500 als auch 505 nm fehlen. Wegen der begrenzten Auflösung und Dynamik bei dieser Polychromatoreinstellung wird nur der Mittelwert von ca. 503 nm angezeigt (Bild 6).

Bild 5...8

Die Beugungseffizienz (η) des verwendeten Materials hat einen entscheidenden Einfluss auf die Intensität des gebeugten (monochromatischen) Strahls. Dieser sehr komplexer Parameter entscheidet letztlich über die Güte eines AOTFs: η = η² L Pa M2/2λ² H mit Pa als akustische Leistung und H als Höhe der aktiven Apertur. M2 ist die Übertragungsgüte, die sogenannte „figure of merit”: M2 = n6 p²/ρ Va ²m mit ρ als Materialdichte.

Die den Anwender interessierende Lichtintensität der 1. Beugungsordnung I 1 zu der einfallenden Lichtintensität I 0 wird schließlich gegeben: I 1/I 0 = η max sin² [Lη L M2 Pa / 2 Hλ²]². Wird die berechtigte Frage nach dem Wirkungsgrad gestellt, dann wird die Materialauswahl durch die sich widersprechenden Materialeigenschaften, vor allem durch die sogenannten „figure of merit” M2 eingeschränkt. Die Natur hat es so eingerichtet, dass kein ideales Material zu haben ist!

Mono- oder ­multispektral?

Bei einem gegebenen AOTF erfolgt die Wellenlängenselektion durch die angelegte akustische Frequenz fa0. Zu jeder Frequenz gehört nach der Kalibrierungskurve in Bild 4 eindeutig eine Wellenlänge λ0. Wird der Piezotransducer über einen Frequenzmischer und nachgeschalteten Leistungsverstärker von mehreren RF-Generatoren fa1, fa2, fa3, fan gleichzeitig betrieben, dann werden auch gleichzeitig mehrere Wellenlängen λ1, λ2, λ3...λn ausgewählt. Auf diese Weise lassen sich polychromatische Lichtquellen realisieren, bzw. Mehrfachwellenlängen-Messungen durchführen. Wird die Ausgangsleistung jedes einzelnen RF-Generators mit unterschiedlichen Frequenzen ω1, ω2, ω3...ωn amplitudenmoduliert, dann können photoempfängerseits nach einer phasenempfindlichen Gleichrichtung die einzelnen Wellenlängen λ1, λ2, λ3...λn auseinandergehalten werden. In [10] wird die simultane Konzentrationsbestimmung in einer Verdünnungsreihe von Rhodamin, Fluorescein, DMP und Eosin beschrieben. Die 4 RF-Generatoren verantwortlich für die Exitationswellenlängen und die 4 RF-Generatoren für die Emissionswellenlängen wurden jeweils paarweise sinusförmig amplitudemoduliert.

Fixe- oder variable Bandbreite?

Die minimale Bandbreite Δλ eines AOTFs ist durch die mechanische Konstruktion, d. h. durch die Wirkungslänge L des Kristalls gegeben. Δλ lässt sich durch die Konstruktion nicht verkleinern, jedoch aber verbreitern! Legt man bei der mechanischen Konstruktion die erforderliche minimale Bandbreite zu Grunde, dann kann diese einfach nach der oben beschriebener multispektralen Methode programmgesteuert vergrößert werden. Für eine ausgewählte Wellenlänge λ0 und entsprechende akustische Frequenz fa0 ergibt sich aus dem Diagramm (Bild 3) die Halbwertsbreite Δλ. Werden in einem spektralen Abstand von

λ0 = λ0 + 2Δλ, λ0 = λ0 - 2Δλ

weitere von dem RF-Generatoren erzeugte akustische Frequenzen angelegt, dann addieren sich die einzelne Spektren und es entsteht eine dem klassischen Interferenzfilter ähnliche, jedoch programmierbare 1, 2, 3 usw. Cavity-Filterkurve.

Das akustooptische ­Spektralphotometer

Nach dem Motto „Ein Fluoreszenzphotometer kann auch als Absorptionsphotometer und auch als (unempfindliches) Luminometer betrieben werden” betrachten wir die aufwendigste Konstruktion, das Spektrofluorometer und seine Betriebsarten. Neben der elektronischen Ansteuerung des AOTF als „Rapid Scanning Mono­chromator” bzw. Polychromator bietet die Akustooptik weitere attraktive Möglichkeiten.

Der AOTF kann gleichzeitig auch als Schalter betrieben werden. Mit einer Schaltzeit von 16 μs (Paratellurit) kann die Anregungsenergie abgeschaltet werden und anschließend die Fluoreszenzabklingkurve bei den Lanthaniden gemessen werden: „Time-Resolved Fluoreszenz”.

Unser akustooptischer Monochromator erzeugt nur Strahlen der 0., +1., –1. Ordnung. Die Strahlen der +1. und –1. Ordnung sind zueinander senkrecht polarisiert, d.h. der Kristall liefert bereits die Voraussetzungen für die Polarisations-Fluoreszenzspektroskopie. Der akustooptische Monochromator lässt sich leicht kaskadieren, wodurch ein lichtstarker Doppelmonochromator entsteht.

Anhand von 2 Beispielen sollen nun die Funktionsweisen dargestellt werden: Das Exitationsmodul und das Emissionsmodul des μFAOS (Fluores­cence Acousto-Optical Spectrometer) sowie das Emissionsmodul des LF 401 Lambda (Laser-Fluoroskop).

Der Entladungsbogen der Xenon-Hochdrucklampe befindet sich in einem Brennpunkt des Ellipsoidspiegels. Er wird auf dem zweiten Brennpunkt (Lochblende als Ersatzlichtquelle) abgebildet und anschließend parallelgerichtet (schematische Darstellung Bild 9). Dieses 9-mm-Durchmesser-Strahlenbündel trifft nun auf die 10 × 10-mm-Eintrittsfläche des dispersives Elementes (AOTF) und wird anschließend gebeugt in 0., -1., +1. Ordnung. Der Separationswinkel beträgt bei Paratellurit ca. 6°. Die 0. Ordnung wird aus dem Strahlengang mit einem 45°-Spiegel ausgelenkt und in einer schwarzen Ulbricht-Kugel absorbiert. Um die Anregungsenergie zu erhöhen, werden die beiden Strahlenbündel der ±1. Ordnung durch ein Rochon-Prisma wieder zusammengeführt. Die 1-mm-Durchmesser-Lochblende wird dann auf dem Kavitätsboden der Mikrotiterplatte abgebildet. In der Polarisations-Fluoreszenzbetriebsart wird einer der beiden Ordnungen aus dem Strahlengang ausgeschwenkt. Im Emissionsmodul (Bild 11) wird die fluoreszierende Kavität als Lichtquelle betrachtet und auf die beiden Photomultiplier abgebildet. Der Forderungen nach breiter Durchstimmbarkeit sowie nach einem parallelen Strahlbündel wurde konstruktiv Rechnung getragen: Eine asphärische Spiegeloptik wurde realisiert. Die elektrolytisch abgeformten elliptischen und Paraboloid-Spiegel können sehr kostengünstig produziert werden und weisen weder chromatische noch sphärische Fehler auf.

Bild 9 + 10

Bei dem Laser-Fluoroskop (Bild 11) dient das lichtstarke AOTF-Spektrometer für die spektral aufgelöste Erfassung schwacher Fluoreszenzen. Als Anregungsquelle dient in diesem Gerät ein Stickstofflaser, dessen Licht in eine faser-optische Sonde eingekoppelt wird. Mittels dieser Sonde wird die Probenfluoreszenz angeregt und gleichzeitig partiell gesammelt und zum Messgerät zurückgeführt. Für die Analyse wird das Fluoreszenzlicht nach dem Austritt aus der Lichtleitfaser parallelisiert und anschließend in den Monochromator abgebildet. Den prinzipiellen Aufbau des AOTF-Monochromators zeigt Bild 11. Mittels diesen Verfahrens lassen sich mit faseroptischen Sonden schwache Fluoreszenzen von organischen und von festen Proben und von Lösungen messen [15].

Bild 11

Literatur

 [1]Chang I.C. Acousto-Optic Tunable Filters, Seiete 145 u. 147 in Berg N. J. – Pellegrino J. M.: Acousto-optic signal processing: theory and implementation. Marcel Dekker, Inc. New York 1996, ISBN 0-8247-8925-3.

 [2]Barócsi A. et. al. : Two-wawelength Multipurpose Portable Chlorophyll Fluorometer and its Application in Field Monitoring Phytoremedation. Mesaurement Science and Technology 2000 (11), 717-729.

 [3]Chang I. C.: Collinear Beam Acousto-Optic Tunable Filters. Electronic Letters 1992(28), 1255.

 [4]IFU GmbH. D-09244 Lichtenau, ­Gottfrid-Schenker 18, Firmenschrift AOS µCHRON 4.

 [5]IFU GmbH. Offenlegungsschrift DE 197 13 254 A 1 Akusto-optische Filter.

 [6]Fischer M.- Tran C.D.: Investigation of Solid-Phase Peptide Synthesis by the Near-Infrared Multispectral Imaging Technique: A Detetction Method for Combinatorical Chemistry. Analytical Chemistry 1999 (71), 2255-2261.

 [7]Gooch Housego Ltd. Ilminster Somerset U.K AO Tunable Filters, Guidance Note for Engineers: TDS034; 10/96.

 [8]Molchanov, V. Ya.-Makarov O.Yu: Phenomenological method for broadband electrical matching of acousto-optical device Piezotransducers. Opt. Eng. 1993(65), 1127-1135.

 [9]Tran C. D.: Acousto-Optic Devices. Analytical Chemistry 1992(64), 971-981.

[10]Tran C. D.: Spectrofluorometer Based on Acousto-Optic Tunable Filters for Rapid Scanning and Multicomponenet Sample Analyses. Analytical Chemistry, 1993(65), 1675-1981.

[11]Tran C.D., Huang G-C.: Characterization of the collinear beam acousto-optic tunable filter and its comparison with the noncollinear and the integrated acousto-optic tunable filter. Opt. Eng. 1999 (38), 1143-1148.

[12]Troy A.A.,et. al: Development of Novel Fluorimeter Based on Superluminescent Ligh-Emitting Diodes and Acousto-Optic Tunable Filter and Ist Application in the Determination of Chlorophylls a and b. Applied Spectroscopy 1997(51), 1603-1606.

[13] Scharff, W. Zeitaufgelöste AO-Spektroskopie und deren Applikation in der Mikrobiologie, Tagungsband, Tagung Sensorik in der Industrie Jena 6./7. 10. 2000.

[14]Vizen F. L. et al. Optical Spectrometer Offenlegungsschrift SU 1707 484.

[15]Büchner M., R. Huber, C. Sturchler-Pierrath, M. Staufenbiel and M. Riepe: “Impaired Hypoxic Tolerance and Altered Protein Binding of NADH in Presymptomatic APP23 Transgenic Mice“, Neuroscience Vol. 114, No. 2, pp. 285-289, 2002.

[16]Qin, C.S. et. al. Low drive power, sidelobe free acousto-optic tunable filters/ switches Electronics Letters 1995(31), 1237-1238.

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