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Was ist real? - Direkte Mikrobiologie in der Umweltanalytik

Was ist real?Direkte Mikrobiologie in der Umweltanalytik

Die „direkte Mikrobiologie“ will möglichst nah an die reale, mikrobiologische Situation einer zu untersuchenden Probe kommen. Die Fähigkeit auf künstlichen Nährmedien wachsen zu können spielt bei dieser Art von Analyse keine Rolle. 

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Was ist real?: Direkte Mikrobiologie in der Umweltanalytik

Die massive Verbreitung der Mikroorganismen und die damit einhergehende Komplexität stellte die Analytik schon immer vor große Herausforderungen. Mit der eingeführten Methode der Kultivierung durch den deutschen Mikrobiologen Robert Koch, stand Ende des 19. Jahrhunderts zum ersten Mal ein Werkzeug zum Nachweis zur Verfügung – wenn auch ein erheblich eingeschränktes Werkzeug, da es nur zur Analyse von kultivierungsfähigen Mikroorganismen verwendet werden konnte.

Heute ist bekannt, dass nur ein Bruchteil der Bakterien auf künstlichen Nährmedien kultiviert werden kann. Bis zu 99,9 % wachsen nicht auf künstlichen Medien. Diese Anomalie („the great plate count anomalie“) ist bereits seit Jahrzehnten bekannt. Die nicht-kultivierbaren Bakterien werden daher auch die unsichtbare Mehrheit („the unseen majority“) genannt. Sie besteht aus zwei wesentlichen Gruppen: Die erste Gruppe zählt zu den „viable but non-culturable“ (VBNC) Bakterien. Diese sind in einem Zustand, in dem sie zwar lebensfähig, aber nicht vermehrbar sind. Die zweite Gruppe zählt zu den grundsätzlich nicht-kultivierbaren Bakterien.

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Proben enthalten oft komplexe Populationen
Der Begriff der mikrobiologischen Umweltanalytik, in der hauptsächlich Proben aus Wasser, Boden und Luft analysiert werden, ist sehr weit gefasst. Die „Umwelt“ kann sowohl als natürliche Umgebung der Bakterien (z.B. See, Boden), aber als auch als künstliche Umgebung (z.B. Abwasserreinigungsanlage) definiert werden. In diesen Proben liegen die Bakterien oft in komplexen Populationen vor, die den Bakterien Vorteile beim Überleben sichern. Hierzu dienen u.a. die gemeinschaftliche Verwertung von organischen Nährstoffen, die Abwehr von Feinden durch das Kollektiv oder die Schaffung von verschiedenen Lebenszonen (z.B. aerob und mikro-anoxisch).

Abwasserprobe

Diese Ko-Existenz der Bakterien in Populationen ist ein wesentlicher Grund für deren Nicht-Kultivierbarkeit, da die Abbildung dieser komplexen Lebensgemeinschaften auf einem künstlichen Nährmedium unmöglich ist. Die Untersuchung einer Probe mittels Kultivierung kann demnach niemals auch nur annähernd ein reales Abbild der Probe liefern.

Doch was heißt in diesem Zusammenhang überhaupt „real“?

Was ist real?
Ein reales Abbild einer Probe wiederzugeben, kann auf verschiedenen Ebenen erfolgen. Im einfachsten Fall wird versucht einen Summenparameter zu bestimmen, zum Beispiel die Lebendkeimzahl. Aber bereits hier fängt das Dilemma an. Die Lebendkeimzahl bezieht sich auf den Anteil der Bakterien, der nicht nur „lebt“, sondern auch fähig ist zu wachsen und sich zu verdoppeln. Dadurch bezieht sich dieser Parameter jedoch wieder auf die Methode der Kultivierung, die wiederum nicht geeignet ist, die natürlichen mikrobiologischen Verhältnisse einer Probe zu erfassen. Um dieses Dilemma zu umgehen, gibt es den Parameter Gesamtzellzahl. Hierbei werden alle Bakterien erfasst, egal ob sie lebend, tot oder kultivierungsfähig sind. Meist ist jedoch die Angabe von toten Zellen irrelevant und nur im Sinne einer reinen Bakterienmasse nützlich. Wesentlich wichtiger dagegen ist die Zahl der lebenden, also stoffwechselaktiven Zellen. Hierzu wiederum sind Lebendfarbstoffe notwendig, die jedoch fehlerbehaftet sind. Wenn also nicht einmal ein Summenparameter ein Abbild der Realität ermöglicht – wie soll das bei komplexeren Parametern möglich sein?

filamentöse Bakterien

Die Antwort ist: Es gibt (bislang) keine Technologie, die einen Einblick in die reale mikrobiologische Situation in der Probe ermöglicht. Daher ist immer nur eine Annäherung an die Realität möglich. Und genau hier unterscheiden sich die zu verwendenden Methoden!

Aus obigen Gründen kann die konventio-nelle, kulturbasierte Mikrobiologie ausgeschlossen werden. Sowohl das Plattengussverfahren als auch der direkte Ausstrich von Proben auf Agarplatten oder andere kulturbasierte Methoden wie die „Bunte Reihe“ können die Realität nicht wiedergeben, sind stark fehlerbehaftet und scheiden für eine realistische Darstellung der Mikrobiologie grundsätzlich aus. Selbst MALDI-TOF als technisch fortschrittliche Methode ist „nur“ der indirekten Mikrobiologie zuzuordnen und damit ausschließlich geeignet, kultivierungsfähige Bakterien nachzuweisen.

Legionellen im Abwasserablauf meist fehlerhaft bestimmt
Doch selbst der Nachweis von „nur“ kulturfähigen Bakterien kann in komplexen Proben stark fehlerbehaftet sein. So konnten eigene Untersuchungen nachweisen, dass der kulturbasierte Nachweis von Legionellen in Abwasserproben auf der Grundlage der Trinkwasserverordnung (TVO) ein fehlerhaftes Ergebnis liefert. Im Gegensatz zu Trinkwasserproben ist der Ablauf von Abwasserreinigungsanlagen wesentlich höher mit anderen Bakterien belastet. Bei der Untersuchung nach TVO wird die Probe nach Filtration auf selektivem Nährmedium bebrütet. In Trinkwasserproben hemmt bei diesem Vorgehen die geringe Anzahl an anderen Bakterien die Legionellen meist nicht in ihrem Wachstum. Doch im Abwasser ist der Konkurrenzdruck wesentlich höher und die Legionellen werden teilweise in ihrem Wachstum unterdrückt.

Die Folge ist ein Ergebnis, welches die Anzahl der Legionellen im Abwasser stark unterschätzt. Selbst eine der Filtration vorgeschaltete Verdünnung der Abwasserproben schafft keine Abhilfe, da die Bakterien in schlecht auftrennbaren Populationen assoziiert sind. Der Fall Warsteiner aus dem Jahr 2013 führte zwar zu einer Verschärfung der Legionellenanalytik in Abflüssen von Abwasserreinigungsanlagen, doch ist die Aussagekraft der Analysen bei der Verwendung von indirekten Methoden nur gering.

VIT Gensondentechnologie

Direkte Mikrobiologie schließt Kultivierungsfehler aus
Einen besseren Ansatz zur Analyse von Umweltproben stellt die direkte Mikrobiologie dar. Hierbei wird beabsichtigt, möglichst nahe an die Realität der zu untersuchenden Probe zu kommen. Im Wesentlichen wird versucht, den Fehler bei der Kultivierung auszuschließen, indem die Fähigkeit auf künstlichen Nährmedien zu wachsen bei der Analyse keine Rolle mehr spielt. Doch treten hierbei neue Probleme auf, die ebenfalls zu fehlerhaften Analysen führen. So ist zwar die PCR oder Real-time-PCR eine grundsätzlich direkte Methode, da sie auf Kultivierung verzichtet, doch führt die ungerichtete Amplifikation von Sequenzabschnitten zu Diskriminierungen und damit zu Fehlinterpretationen. Der wichtigste Nachteil ist jedoch die fehlende Lebend/tot-Unterscheidung.

Auch das Next Generation Sequencing (NGS) ist nur begrenzt dafür geeignet, reale Abbilder zu schaffen. Zwar liefert NGS durch den Verzicht auf die Klonierung von DNA-Fragmenten in kürzester Zeit eine beeindruckende Menge an Daten. Aber auch NGS bedarf der PCR-Amplifikation von Fragmenten, was auch hier zu einer Verzerrung der Ergebnisse führt. Überdies muss beim Einsatz von NGS immer auch der Nutzen in der Praxis hinterfragt werden. Während NGS zweifelsohne in der universitären und industriellen Forschung – und dort ganz besonders in der Genomforschung – große Fortschritte bringt, muss die Sinnhaftigkeit in der industriellen Praxis in Frage gestellt werden. Die Datenmengen sind zu groß, die Auswertealgorithmen noch zu unausgereift und die Kosten zu hoch, um den Einsatz von NGS neben der bereits diskutierten Fehleranfälligkeit für die Routineanalytik von Umweltproben zu empfehlen.

Es gibt daneben noch eine Reihe weiterer Methoden der direkten Mikrobiologie, wie immunfluoreszenzbasierte Technologien oder Denaturierungsgradienten-Gelelektrophorese (DGGE). Letztendlich führt jedoch die Intention der Vermeidung eines systematischen Errors (Kultivierungsfähigkeit) zur Einführung neuer Errors (z.B. PCR: selektive Amplifikation; Immunofluoreszenz: Zugänglichkeit). Und bisher wurden nur die Möglichkeiten der Identifizierung diskutiert. Noch komplexer wird es, wenn auch die in der Realität vorhandenen Mengen an Bakterien und bakteriellen Populationen wirklichkeitsnah abgebildet werden sollen. 

VIT Gensondentechnologie für die direkte Mikrobiologie
Die seit zwei Jahrzehnten verwendete und international eingesetzte VIT® Gensondentechnologie (s. Bild oben rechts), die den industriellen Standard der FISH-(Fluorescence In Situ Hybridisation-)Technologie darstellt, ermöglicht eine direkte Mikrobiologie mit unmittelbarem Kundennutzen. Hierbei werden für Bakterienarten oder -gruppen spezifische und fluoreszenzmarkierte Gensonden in die Original-Probe eingebracht, wo sie sich in den jeweiligen Zielbakterien anheften und diese spezifisch sichtbar machen (Bild 1a, b). Dadurch werden die Bakterien und Bakterienpopulationen nicht nur identifiziert, sondern auch quantifiziert und – wenn gewünscht – auch visualisiert. Die Auswertung kann grundsätzlich mit einem Mikroskop, einem Durchflusszytometer oder anderen optischen Instrumenten erfolgen. Durch die Einsicht in die realen Vorkommnisse in der untersuchten Probe können unmittelbar Rückschlüsse gezogen und damit anwendungsspezifische Lösungen für die unterschiedlichen industriellen Fragestellungen gefunden werden.

Cui bono?
Grundsätzlich lohnt es sich in der mikrobio-logischen Analytik – und ganz besonders in der Umweltanalytik – die Frage „Cui bono“ zu stellen. Wem nutzt es? Ist es sinnvoll eine Umweltprobe zu kultivieren und dann die Ergebnisse als „mögliches Abbild der Realität“ auszuweisen? Ist es sinnvoll Millionen von Sequenzen zu analysieren, um dann Gigabyte von Daten auswerten zu müssen, die ohnehin nicht zu einem praxisrelevanten Ergebnis führen? Es gibt in der anwendungsspezifischen Umweltanalytik noch eine große Lücke zwischen dem kulturbasierten und gerichteten Nachweis von Ziel- oder Indikatororganismen und der ungerichteten, forschungsgetriebenen Gewinnung und Auswertung von Sequenzdaten.

Cui bono? Sicherlich der Geräteindustrie, die sich auf die Entwicklung und Herstellung von Automaten konzentriert, die mit hohen Entwicklungskosten behaftet in größeren Stückzahlen produziert werden müssen.

Cui bono? Es nutzt auch den traditionellen mikrobiologischen Analyselabors, die durch die schwerfällige deutsche Bürokratie und deren geringen Innovationsgrad nicht gezwungen werden, vom Goldstandard der Kultivierung abzurücken.

Doch es nutzt nicht dem Kunden, der an praxisrelevanten Ergebnissen interessiert ist oder eine Lösung für sein Problem sucht. Es nutzt nicht dem Kunden, der die Aufschlüsselung seiner Probe bis zu dem Grad benötigt, an dem er die Ergebnisse nicht nur versteht, sondern auch zu nutzen vermag. Daher sind sowohl der Goldstandard der Mikrobiologie als auch die aktuellen Entwicklungen neuer Hochdurchsatztechnologien mit einer Portion Skepsis zu betrachten. Wenn die Durchführung einer Analyse stärker im Vordergrund steht als die Interpretation der Ergebnisse und wenn nicht mehr die Lösung eines Problems im Vordergrund steht, dann gilt es nicht nur zu fragen Cui bono?, sondern: Quo vadis Mikrobiologie?

Dr. Jiri Snaidr
Vermicon AG, München

Weiterführende Literatur
Amann R, Snaidr J, Wagner M, Ludwig W, Schleifer KH. In situ visualization of high genetic diversity in a natural microbial community. J Bacteriol. 1996 Jun;178(12):3496–3500.
Snaidr J., Amann R., Huber I., Ludwig W., Schleifer K H., Phylogenetic analysis and in situ identification of bacteria in activated sludge. Appl Environ Microbiol. 1997 Jul; 63(7): 2884–2896.
Staley, J.T., Konopka, A., 1985. Measurement of in situ activities of non-photosynthetic microorganisms in aquatic and terrestrial habitats. Annu. Rev. Microbiol. 39, 321e 346.
Van Nevel, S., Buysschaert, B., De Roy, K., De Gusseme, B., Clement, L. and Boon, N. (2017) Flow cytometry for immediate follow-up of drinking water networks after maintenance. Water Res 111, 66–73. 


Der Autor ist Gründer und Vorstandsvorsitzender der vermicon AG. Das Unternehmen entwickelt seit 20 Jahren „Out of the box“-Lösungen für die Mikrobiologie. Vermicon ist Mitglied des Unternehmerkreises Umweltanalytik des Deutschen Verbandes Unabhängiger Prüflaboratorien (VUP).

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