UV/VIS-Spektroskopie

Analyse von Vitamin B12

Vitamin B12 wird in der Pharma-, Lebensmittel- und Getränkeindustrie verwendet. Die Autorin beschreibt den Einsatz von UV/VIS-Spektroskopie für die Analytik von Vitamin-B12-Derivaten.

Vitamin B12 ist ein häufig verwendetes Nahrungsergänzungsmittel und ein pharmazeutischer Wirkstoff, der in der Pharma-, Lebensmittel- und Getränkeindustrie eingesetzt wird. Die Analyse von Vitamin B12 kann der Identifizierung und Reinheitsprüfung der eingehenden Waren oder eine Gehaltsbestimmung des Endprodukts dienen. Im Folgenden wird beschrieben, wie UV/VIS-Spektroskopie bei verschiedenen Analysetypen eingesetzt werden kann.

Vitamin B12 (Cobalamin), das Cobalt als Zentralatom enthält, spielt eine wichtige Rolle für die Funktion von Gehirn und Nervensystem sowie für die Bildung roter Blutkörperchen. Zu den natürlichen Vitamin-B12-Quellen zählen Produkte tierischen Ursprungs. Aus diesem Grund haben eher Vegetarier einen Mangel an Vitamin B12. Aber auch Menschen mit einer Malabsorption können an einem Vitamin-B12-Mangel leiden.

Bild 1: Das Spektrum von Cyanocobalamin zeigt die drei charakteristischen Peaks bei 278, 361 und 550 nm. © Mettler-Toledo

In der Pharma- und der Lebensmittelindustrie werden die Vitamin-B12-Derivate Cyanocobalamin oder Hydroxocobalamin häufiger als Cobalamin verwendet, da sie eine bessere Stabilität und auch niedrigere Produktionskosten haben. Diese Derivate werden im menschlichen Körper leicht in Cobalamin umgewandelt. Vitamin B12 kann mit Hilfe der UV/VIS-Spektroskopie analysiert werden: Es zeigen sich im Spektrum dann drei Peaks bei 278, 361 und 550 nm (Bild 1). Der intensivste Peak liegt bei 361 nm. Der Peak bei 550 nm ist für die rote Farbe der Substanz verantwortlich.

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Annahmekriterien und gemessene Ergebnisse einer Cyanocobalamin-Probe. © Mettler-Toledo

Qualitative Analyse

Zur Identifizierung von Cyanocobalamin müssen alle drei Peaks überprüft werden. Darüber hinaus werden das Absorptionsverhältnis an den Peaks bei 361 und 278 nm sowie das Verhältnis an den Peaks 361 und 550 nm berechnet, und diese müssen in einem bestimmten Bereich liegen (siehe Tabelle).

Quantitative Analyse

Die quantitative Analyse mit UV/VIS-Spektroskopie kann zum Bestimmen der Cyanocobalaminkonzentration eingesetzt werden. Dabei wird eine unbekannte Probe mit einem Standard einer bekannten Konzentration verglichen. Auf Grundlage einer Referenzmessung kann die Konzentration der unbekannten Probe einfach berechnet werden. Das Absorptionsmaximum von 361 nm wird in der Regel zur Konzentrationsbestimmung verwendet. Wenn eine Mischung mit Störsubstanzen bei 361 nm analysiert wird, kann auch der Peak bei 550 nm verwendet werden.

Analyse der Derivate

Da Cyanocobalamin zu Hydroxocobalamin abgebaut werden kann, ist es oft interessant, die Menge jedes Derivats, das in derselben Mischung vorkommt, zu vergleichen. Die Zusammensetzung kann für gewöhnlich durch das Absorptionsverhältnis bei 351 und bei 361 nm ermittelt werden. Obwohl das Spektrum von Hydroxocobalamin dem von Cyanocobalamin ähnelt, ist es vom pH-Wert abhängig. Daher besteht eine alternative Methode darin, die Absorption bei 361 nm von einer Lösung mit pH 8 gegen eine Lösung mit pH 2 zu messen, was die Spektralverschiebung von Hydroxocobalamin mit dem pH-Wert widerspiegelt (Görög, S.: Ultraviolet-visible spectrophotometry in pharmaceutical analysis, 1995).

Identifizierung von Cyanocobalamin

Hier wird das Verfahren für die qualitative Analysemethode für Vitamin B12 gemäß USP 35- NF 30 beschrieben. Probenvorbereitung: Ca. 300 mg Cyanocobalamin-Standard, der 1,07 % Cyanocobalamin und Mannitol enthält, wird in 100 ml gereinigtem Wasser verdünnt. Anschließend wird eine 1 : 100-Verdünnung vorbereitet. Ein Aliquot der Cyanocobalamin-Lösung wird in eine 1-cm-Quarzglasküvette übertragen und das volle Spektrum von 200 bis 700 nm mit dem UV7-Spektrophotometer von Mettler-Toledo gemessen. Eine Blanko-Küvette gefüllt mit gereinigtem Wasser wird als Referenz verwendet.

Als Test-Annahmekriterien wird das Vorhandensein der drei Maxima 278 ± 1, 361 ± 1 und 550 ± 2 nm überprüft (vgl. Bild 1). Das Absorptionsverhältnis A361/278 muss im Bereich von 1,70 bis 1,90 liegen und das Verhältnis A361/A550 im Bereich von 3,15 bis 3,40. In der Tabelle sind die Annahmekriterien und die Ergebnisse einer gemessenen Vitamin-B12-Probe dargestellt. Hier werden alle Kriterien erfüllt, was die Identität und Reinheit von Cyanocobalamin in der untersuchten Probe bestätigt.

Vordefinierte Methode

Bild 2: Das „UV7 Excellence“-Spektrophotometer von Mettler-Toledo beinhaltet eine vordefinierte Methode. © Mettler-Toledo

Für einfache Routineanalysen enthält das UV7-Spektrophotometer (Bild 2) eine vordefinierte Methode zur Identifizierung von Vitamin B12, die den Spektrumscan und die automatische Bewertung der relevanten Ergebnisse umfasst. Die Peaks im Spektrum werden ermittelt und ihre Positionen mit Nenndaten verglichen, wobei zulässige Toleranzen berücksichtigt werden.

Auch die Absorptionsverhältnisse werden automatisch berechnet und mit den Nennwerten verglichen, so dass das Endresultat alle Annahmekriterien für die Identifizierung von Cyanocobalamin widerspiegelt. Die Methode lässt sich an die Benutzeranforderungen anpassen. So ist die Identifizierung von Cyanocobalamin eine schnelle Methode mit automatischer Auswertung, wodurch zudem das Fehlerrisiko reduziert wird.

AUTORIN
Dr. Birgit Pils
Mettler-Toledo GmbH, Gießen
Tel. 0641/507-0
info.mtd@mt.com
www.mt.com/uv-vis

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