Mikroplastik-Analyse

1,2,3… Gibt es eine Alternative zum Auszählen von Partikeln?

Über eine Spektroskopie-Methode mit Potenzial für die Mikroplastik-Analyse berichten die Wissenschaftler der Universität Koblenz.

© Universität Koblenz-Landau
Noch gibt es für Mikroplastik keine Routineanalytik im Sinne standardisierter Probenvorbereitung und auch nicht genügend unterschiedliche Verfahren, um Ergebnisse vergleichen zu können. Eine größenunabhängige und schnelle Analysemethode ist die qNMR-Methode, die sich für die qualitative und quantitative Analyse von Mikroplastik-Partikeln eignet. Für Umweltproben wurde eine Probenvorbereitung speziell für die Mikroplastik-Analytik mittels qNMR-Spektroskopie entwickelt.

Mikroplastik (MP) stellt ein zunehmend signifikantes Problem für die Umwelt dar und ist mittlerweile global präsent. Um die Verbreitung und Auswirkung von MP auf die Umwelt im Ansatz zu verstehen ist es wichtig, MP über einen weiten Größenbereich zu identifizieren und zu quantifizieren [1]. Bis jetzt werden Mikroplastik-Partikel (MPP) in Umweltproben hauptsächlich mittels FTIR- oder Raman-Spektroskopie identifiziert und durch zeitaufwändiges Auszählen quantifiziert [2, 3]. Die MP-Konzentration wird somit meist nur als MPP-Anzahl pro Volumen oder Trockenmasse angegeben. Um eine Vergleichbarkeit und Vereinheitlichung von Ergebnissen zu gewährleisten ist die Angabe der MP-Konzentration als MP-Masse pro Volumen oder Trockenmasse allerdings genauso wichtig [4]. Die Vergleichbarkeit der Studien untereinander wird zudem durch die Tatsache erschwert, dass es bis jetzt keine vereinheitlichte Probenvorbereitung für unterschiedliche Umweltmatrizes gibt [1, 4].
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Das aktuelle Hauptproblem in der MP-Analytik ist somit das Fehlen einer Routineanalytik im Sinne standardisierter Probenvorbereitung sowie eines Portfolios unterschiedlicher sich gegenseitig ergänzender analytischer Verfahren, durch die Studien untereinander besser verglichen und somit die globale Ausbreitung und Auswirkung von MP besser verstanden werden können [5]. Auf Grundlage der beschriebenen Probleme in der MP-Analytik wurde eine alternative Quantifizierungsmethode angewendet, welche es ermöglicht, eine Konzentrationsangabe von MP in Umweltproben, beispielsweise in mg MP pro g Umweltprobe, anzugeben, ohne diese auszählen zu müssen. Es handelt sich dabei um die größenunabhängige, schnelle und einfache quantitative Analyse von MP mittels 1H-qNMR-Spektroskopie [6, 7].

Mikroplastik-Analytik mittels qNMR

Die qNMR-Methode ist erst in den letzten zehn Jahren in den Vordergrund gerückt und wird vermehrt in der Metaboliten- sowie Toxizitätsforschung angewendet [8, 9]. Das Grundprinzip, auf dem die qNMR-Methode aufbaut, ist die Proportionalität zwischen Signalfläche und Anzahl der Resonanzkerne. Hauptsächlich wird in der Literatur die Absolutbestimmung mittels der „Interner-Standard-Methode“ beschrieben, bei der allerdings das Wissen der genauen Struktur des Analyten vorausgesetzt wird [8].

Für MP-Partikel ist dies meist nicht der Fall, weshalb wir im Fall der MP-Analytik auf die Kalibriergeradenmethode zurückgreifen [6]. Des Weiteren muss darauf geachtet werden, dass die MPP vollständig in einem geeigneten deuterierten Lösungsmittel gelöst sind und im optimalen Fall keine Signalüberlagerung des Restprotonensignals mit dem Analytsignal auftritt, da das Restprotonensignal als interner Standard dient [6]. Beispielsweise eignet sich für Low-Density-Polyethylen (LDPE) Toluol-d8 (60 °C), für Polystyrol (PS) CDCl3 (RT) und für Polyethylenterephthalat (PET) eine 4 : 1-Mischung aus CDCl3 und Trifluoressigsäure (TFA) bei Raumtemperatur (RT). Für LDPE, PS und PET liegt die Linearität der Methode bei > 0,994 R2 und die Richtigkeit zwischen 81,2 – 108,1 % [6]. Die Nachweisgrenze der drei Polymertypen liegt im unteren umweltrelevanten Bereich bei ca. 20 µg/ml.

Bild 1: Angegeben ist ein Beispielspektrum mit der Zuordnung der 1H-NMR-Signale der entsprechenden Struktur des jeweiligen Polymers und eine Kalibriergerade mit dem dazugehörigen Vertrauensbereich im Konzentrationsbereich von ca. 0,5 - 3,0 mg/ml für LDPE-Granulat, PET-Fasern und PS-Kügelchen. Zusätzlich angegeben sind die Lösungsmittelbedingungen und der Regressionsfaktor für die Mikroplastik-Partikel (modifiziert nach [6]). © Universität Koblenz-Landau

Alle 1D1H-NMR-Experimente wurden an einem Jeol® 500 Spektrometer, 500 MHz mit einem 5 mm TH ATM Probenkopf aufgenommen und mit der Software Mestrenova ausgewertet. Bei der Auswertung der Spektren muss dabei besonders Wert auf die Phasenkorrektur, Basislinienkorrektur und Integration gelegt werden (s. Bild 1).

Probenvorbereitung von Umweltproben

Um Umweltproben analysieren zu können wurde eine Probenvorbereitung speziell für die MP-Analytik mittels qNMR-Spektroskopie entwickelt, die zu reproduzierbaren Ergebnissen unabhängig von der spezifischen Matrix der MPP führt [7]. Der erste Schritt beinhaltet den chemischen Aufschluss, um organische Matrixbestandteile bestmöglich vom MP zu entfernen. Als chemisches Aufschlussreagenz dient eine Mischung aus ca. 50 %iger Schwefelsäure anstatt hochkonzentrierter Schwefelsäure und 30 %iger Wasserstoffperoxid-Lösung im Verhältnis 1 : 1. Das Abfiltrieren von MP-Partikeln sowie organischer und/oder anorganischer Feststoffe beinhaltet Schritt 2.

Da für die 1H-NMR-Messungen die MPP in Lösung vorliegen müssen, ist es wichtig, selektiv die MPP vollständig und ohne Verluste in Lösung zu bringen und dabei von anderen durch die Säurebehandlung nicht angegriffenen Matrixbestandteilen zu trennen. Es wurden verschiedene Vorgehensweisen getestet, wobei die Methode des Abspülens einer P4-Fritte die besten Ergebnisse zeigte. Der nächste Schritt ist das Trocknen des Rückstandes bei 60 °C im Trockenschrank. Da dieses Probenvorbereitungsschema für verschiedene Umweltmatrizes entwickelt wurde, müssen gegebenenfalls die Schritte 4a – 4c hinzugefügt werden (Bild 2). Dies ist abhängig davon, ob im Rückstand anorganische Bestandteile wie zum Beispiel Sediment enthalten sind. Ist dies der Fall, wird der Rückstand in einem geeigneten undeuterierten Lösungsmittel unter Rühren gelöst (Schritt 4a), anschließend wird ein definiertes Volumen der gelösten MP-Partikel entnommen (4b) und schließlich nochmals bei 60 °C im Trockenschrank eingeengt (4c).

Der finale Schritt 5 der Probenvorbereitung ist nunmehr unabhängig von der spezifischen Umweltmatrix. Der Rückstand (ohne anorganische Bestandteile) wird in dem entsprechenden deuterierten Lösungsmittel gelöst und 700 µl der Lösung in ein NMR-Röhrchen überführt, um direkt im Anschluss gemessen werden zu können.

Bild 2: Probenvorbereitungsschema für verschiedene Umweltmatrizes für die Mikroplastik-Analytik mittels qNMR (modifiziert nach [7]). © Universität Koblenz-Landau

Um die Effizienz der neu entwickelten Probenvorbereitung für die MP-Analytik mittels qNMR zu bestimmen, wurde am Beispiel von PET-Fasern (Länge ca. 500 µm, ø 10 – 20 µm) die Wiederfindungsrate (WFR) der einzelnen Schritte bestimmt. Die WFR für PET-Proben ohne Matrix liegt bei 92,7 ± 1,3 %, für Sediment bei 104,5 ± 3,7 %, für Moselwasser bei 93,5 ± 5,7 %, für aquatischen Biofilm bei 94,7 ± 7,5 % und für Invertebraten bei 72,1 ± 4,6 % [7]. Die Effizienz der Probenvorbereitung ist somit hoch und zudem reproduzierbar – unabhängig von der verwendeten Umweltmatrix.

Matrixeffekte von Umweltproben

Die qualitative, vielmehr aber die quantitative Analyse, kann durch Matrixeffekte der Umweltproben gestört werden. Organische Matrices können störende Signale im 1H-NMR Spektrum hervorrufen, wenn diese 1H-NMR aktive Substanzen enthalten. Daher muss überprüft werden, ob NMR-aktive Matrixkomponenten nach dem chemischen Aufschluss vorhanden sind und welchen Einfluss diese auf die MP-Analyse haben. Bild 3 zeigt die 1H-NMR-Spektren von PET-Fasern, Biofilm-, Invertebrat-, Moselwasser- und Sediment-Modellproben in CDCl3/TFA 4 : 1 [7].

Für die Sedimentmatrix können keine störenden 1H-NMR-aktiven Substanzen in dem Signalbereich 0 - 9 ppm ausgemacht werden. Die Moselwasserprobe weist Signale mit einer geringen Intensität im Bereich von 2,45 ppm und 1,25 ppm auf. Deutlich mehr intensive Signale treten bei dem Biofilm und Invertebraten auf. Die Signale im Bereich von 2,45, 1,65, 1,25 und 0,85 ppm sind typisch für langkettige Ketone und Fettsäuren und können unter anderem durch den chemischen Aufschluss von Lipiden und Lignin auftreten [7]. Für das Beispiel PET wird deutlich, dass trotz der auftretenden Matrixeffekte diese für die qualitative sowie quantitative Analyse nicht störend sind, da die PET-Signale nicht mit den Matrixeffekten überlagern (vgl. Bild 3). Somit kann die üblicherweise genutzte Flächen-Integriermethode (INT-qNMR) verwendet werden.

Bild 3: 1H-NMR Spektren von PET-Fasern, Biofilm, Invertebraten, Moselwasser und Sediment – jeweils nach dem chemischen Aufschluss in CDCl3/TFA 4 : 1 bei RT. Der Bereich, welcher für die qualitative Analyse von PET-Fasern wichtig ist, ist grau markiert und hellgrau der Bereich, welcher für die quantitative Analyse verwendet wird. Grün umrandet ist der Bereich, in dem Matrixeffekte nach dem chemischen Aufschluss der Umweltmodellproben auftreten. © Universität Koblenz-Landau

Die qNMR-Methode bietet allerdings auch eine Lösung für den Fall, dass störende Matrixeffekte, in diesem Fall Matrixsignale, welche mit dem zu integrierenden Analytsignal oder Restprotonensignal teilweise überlagern, auftreten. Dann kann anstatt der INT-qNMR-Methode die Peak-Fitting (PF-qNMR)-Methode angewendet werden. Bei dieser Methode handelt es sich um ein mathematisches Verfahren, bei dem die überlagernden Signale dekonvolutiert werden und somit eine Integration der extrahierten Signale möglich wird [8, 10]. Somit ist eine qualitative und quantitative Analyse von MPP mittels der qNMR-Methode möglich, auch wenn störende NMR-aktive Matrixsignale auftreten [7].

Fazit

Der Vorteil der Methode besteht darin, dass es sich um eine schnelle (< 5 min pro Messung) und einfache Methode handelt. Des Weiteren kann die MP-Konzentration in mg/ml oder g Umweltprobe angegeben werden, wobei eine Missklassifikation wie bei der oftmals durchgeführten optischen Methode sehr unwahrscheinlich ist. Ein weiterer Vorteil besteht darin, dass es sich hierbei um eine Methode handelt, bei der die MPP nicht ausgezählt werden müssen, und es sich zusätzlich um eine größenunabhängige Analysemethode handelt.

Somit bietet die quantitative 1H-NMR Spektroskopie eine gute Alternative für die qualitative und quantitative MP-Analyse und sollte als Routineanalytik in Betracht gezogen werden.

AUTOREN
Nadine Peez, Wolfgang Imhof
Institut für Integrierte Naturwissenschaften
Universität Koblenz-Landau, Koblenz

Referenzen

[1] N.P. Ivleva, et al.: Microplastic in Aquatic Ecosystems, Angew. Chem. Int. Ed. 2017, 56, 1720–1739.

[2] Wendt-Potthoff, K., Imhof, H. K., Wagner, M. et al.: Mikroplastik in Binnengewässern, in: M. Hupfer, H. Fischer (Eds.), Handbuch Angewandte Limnologie, Wiley-VCH, 2017.

[3] A. Käppler et al.: Analysis of environmental microplastics by vibrational microspectroscopy: FTIR, Raman or both?, Anal. Bioanal. Chem. 2016, 408, 8377–8391.

[4] F. Stock et al.: Sampling techniques and preparation methods for microplastic analyses in the aquatic environment – A review, TrAC 2019, 113, 84–92.

[5] C. Zarfl: Promising techniques and open challenges for microplastic identification and quantification in environmental matrices, Anal. Bioanal. Chem. 2019, 411, 3743–3756.

[6] N. Peez et al. The first application of quantitative 1

H-NMR-spectroscopy as a simple and fast method of identification and quantification of microplastic particles (PE, PET and PS), Anal. Bioanal. Chem. 2019, 411, 823–833.

[7] N. Peez et al.: Quantitative analysis of PET microplastics in environmental model samples using quantitative 1H-NMR spectroscopy: Validation of an optimized and consistent sample clean-up method, Anal. Bioanal. Chem. 2019, DOI 10.1007/s00216-019-02089-2.

[8] S.K. Bharti, R. Roy: Quantitative 1H NMR spectroscopy, TrAC 2012, 35, 5–26.

[9] G.F. Pauli et al.: Quantitative 1H NMR. Development and potential of an analytical method, J. Nat. Prod. 2012, 75, 834–851.

[10] Y. Monakhova, B. Diehl: Practical guide for selection of 1H qNMR acquisition and processing parameters confirmed by automated spectra evaluation, Magn. Reson. Chem. 2017, 55, 996–1005.

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