Sein oder Nichtsein

Teil 2 - Identifizierungskriterien für die Tandem-Massenspektrometrie

Die Kombination von chromatographischen Trennungen mit der Tandem-Massenspektrometrie gilt heute als State-of-the-Art in der organischen Spurenanalytik. Insbesondere die LC-MS/MS mittels Triple-Quadrupol hat sich zum Standardwerkzeug in der Pestizid- und Mykotoxin-Analytik entwickelt. Bei der MS/MS steht die Gewinnung von hochselektiven Molekülinformationen durch die gezielte Fragmentierung eines ausgewählten Vorläuferions im Vordergrund. Gemeinsam mit der Retentionszeit entscheiden die Intensitätsverhältnisse der Spaltprodukte maßgeblich über die Identifizierung eines Schadstoffes.

Der Trend in der organischen Spurenanalytik geht unaufhaltsam zur massenspektrometrischen Detektion, da sie höchste Selektivität und damit Sicherheit verspricht. Besonders bewährt hat sich die Tandem-MS (MS/MS) mit Triple-Quadrupolen (QQQ), die sich für quantitative Aufgabenstellungen auf breiter Basis durchgesetzt hat. Sie kombiniert zwei selektive MS-Trennungen seriell über eine Fragmentierung und erzielt damit außerordentliche Identifizierungssicherheiten.

Tandem-MS mit QQQ
Der erste Schritt bei der Identifizierung von Substanzen ist praktisch immer die Retentionszeitinformation der chromatographischen Trennung. Auf die dafür notwendigen Toleranzkriterien in LC und GC wurde im 1. Teil dieses Artikels ausführlich eingegangen. Nachdem die Zielanalyten z.B. durch die HPLC zumindest zum Teil von Begleitstoffen abgetrennt wurden, erfolgt die Ionisierung in der Ionenquelle des MS. Bei der anschließenden Tandem-Massenspektrometrie fällt die erste Wahl auf ein diagnostisches Ion, das häufig die protonierte bzw. deprotonierte Molekülmasse widerspiegelt. Dieses sogenannte Vorläuferion (Precursor-Ion) wird im ersten Quadrupol (Q1) isoliert und in der Stoßzelle (q2) durch CID (Collision Induced Dissociation) zerschlagen (Bild 1).

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Mindestens zwei für den Zielanalyten charakteristische Bruchstücke (blau und schwarz in Bild 1) werden im dritten Quadrupol (Q3 = 2. MS-Stufe) selektiv erfasst und abschließend detektiert (Multiple Reaktion Monitoring MRM). Letztlich resultieren zwei Signalverläufe, deren chromatographische Retentionszeit (RT) gleich ist und deren Peak-Flächenverhältnis charakteristisch für diesen Analyten auf diesem MS-System ist (Bild 2). Dieses Hauptkriterium für die MS-Identifizierung wird als Signalverhältnis, Ion Ratio, Ionenverhältnis, MRM-Verhältnis, etc. bezeichnet und als jener Quotient verstanden, der durch Division des kleineren Signals durch das größere entsteht (meist Qualifier/Target).

Bild 1: Symbolische Darstellung der Multiple Reaction Monitoring-Technik (MRM) mit zwei Übergängen in einem Triple-Quadrupol-MS.

Die Ionenverhältnisse unterliegen natürlich gewissen Schwankungen, die von der Stabilität der Geräte-Elektronik, den konstanten Bedingungen in der Kollisionszelle, dem linearen Bereich des Detektors und eventuellen Signalinterferenzen durch Störstoffe abhängig sind. Frühere Untersuchungen haben gezeigt, dass bestimmte Analyten in der Ionenquelle sogar an verschiedenen Stellen des Moleküls protoniert werden können, und das hängt wiederum auch vom Einfluss der Matrix ab. Die lokal unterschiedlich protonierten Arten derselben Substanz können dann in der Kollisionszelle auch unterschiedlich fragmentieren. Daraus entsteht eine zusätzliche Variationsbreite bei der Bildung von Produkt-Ionen.

Offizielle Regulatorien
Wie Versuche mit reinen Standardlösungen zeigen, schwanken die Ratios sehr oft zwischen unterschiedlichen Geräten. Geringfügiger fallen die Schwankungen innerhalb eines bestimmten Gerätes über die Zeit aus. Zudem sind sie auch teilweise von den Analyten abhängig.

Wie schon im Teil 1 erläutert, besteht eine Reihe von gesetzlichen Regelungen für definierte Applikationen. Die derzeitigen Regulatorien nehmen Bezug auf die notwendigen Toleranzen bei der Retentionszeit (siehe Teil 1) und insbesondere bei den Ionenverhältnissen (siehe Tabelle). Praktisch allen gemeinsam ist, dass sie jeweils zwei Produkt-Ionen verlangen und dass als Bezugsbasis für die Toleranzen die Kalibrierstandards derselben Sequenz herangezogen werden. Bei den Toleranzen finden sich jedoch teilweise erhebliche Unterschiede, was die Höhe und die Art (absolut oder relativ) betrifft. Zudem erscheinen manche Regulatorien wie z.B. die rechtlich verbindliche Entscheidung „2002/657/EC“ der EU-Kommission als nicht mehr zeitgemäß, da sie seit 2002 nicht mehr an die rasante Entwicklung der Gerätetechnik angepasst wurde.

Bild 2: Signalverhältnisse von zwei MRM-Übergängen im Vergleich mit dem erlaubten Toleranzbereich und Retentionszeitfenster.

Der international anerkannte Experte für massenspektrometrische Spurenanalytik am Forschungsinstitut RIKILT (Wageningen NL), Dr. Hans Mol, hat daher die Identifizierungskriterien verschiedener Regulatorien ver- glichen, hinterfragt und erstmals systematische Untersuchungen über die experimentelle Variabilität der entscheidenden Identifizierungskriterien Retentionszeit und Ionenverhältnis durchgeführt. Die aufschlussreichsten Ergebnisse der umfassenden Pestizid-Analysen mit rund 135 000 Ionen-Chromatogrammen [2] und Vergleichsmessungen mit über 4000 Mykotoxin-Matrix-Konzentrations-Kombinationen [3] in fünf Laboren auf verschiedenen Gerätesystemen sollen hier kurz zusammengefasst werden.

Referenzen für Ionenverhältnisse
Auf welchen Referenzwert für das Ionenverhältnis sollte man sich in der Praxis beziehen? Auf jenen von Kalibrierstandards in reinem Lösungsmittel oder doch besser auf Matrix-basierende Ratios von praxisnahen (dotierten) Proben?

Die Erfahrung zeigt, dass es hin und wieder vorkommt, dass die Matrix bei einem der MRM-Übergänge zu Interferenzen führen kann. Dadurch würde bei der vermeintlich praxisnäheren Proben-basierten Version eine Verschiebung der Soll-Ratios auftreten, die noch dazu abhängig von der Konzentration des Zielanalyten ist. Die Matrix induziert aber meist einen konstanten Beitrag, dessen Auswirkung sich mit steigender Analytkonzentration folglich, relativ gesehen, verringert. Werden Proben einer anderen Zusammensetzung oder auch nur unterschiedlicher Konzentra-tionen damit verglichen, werden falsch-negative Entscheidungen wahrscheinlicher.

Bild 3: Plot der relativen Abweichungen der Signalverhältnisse gegen deren relative Intensitäten. Die farbig markierten Toleranzbereiche einer vorgegebenen Regelung zeigen auf, dass die tatsächlichen Abweichungen nicht wie angenommen mit steigender relativer Intensität absinken. © Mit freundlicher Genehmigung von Dr. Hans Mol (RIKILT)

Es ist somit empfehlenswert für die Fest-legung der MRM-Verhältnisse, den Mittelwert über alle reinen Kalibrierstandards derselben Sequenz heranzuziehen. Damit ist auch gewährleistet, dass deren Signalstärken (Signal/Noise, S/N) ausreichend hoch und innerhalb des dynamischen Bereiches sind.

Die Ion Ratios eines bestimmten Überganges einer Verbindung können zwischen verschiedenen Geräten bzw. Typen bei manchen Verbindungen sehr ähnlich sein und bei anderen wiederum stark differieren. Selbst bei einer ganz bestimmten MS/MS-Anlage können sich die Ionenverhältnisse im längeren Zeitverlauf ändern, besonders aber kommt es bei Wartungen, bei jedem neuen Tuning und auch durch Massenachsen-Kalibrierungen zu Veränderungen der Quotienten. Innerhalb einer Sequenz sind die Ion Ratios von Kalibrierstandards (in Lösungsmittel) aber generell recht stabil und auch unabhängig von der Konzentration der Kalibrierstandards.

Variabilität von Ionenverhältnissen
Bei vielen Regulatorien beziehen sich die Abweichungstoleranzen der MRM-Verhältnisse auf die relative Intensität der beiden Produkt-Ionen zueinander. Bei der Regelung „2002/657/EC“ zum Beispiel wird im Intensitätsbereich zwischen 50...100 % eine Toleranz von ±20 % eingeräumt, liegt die Intensität unter 10 %, gilt die viel höhere Toleranz von ±50 % (Bild 3).

Bild 4: Der Plot der relativen Abweichungen der Signalverhältnisse gegen die absoluten Signalintensitäten zeigt eine deutliche Abhängigkeit der Ion Ratio-Differenzen von der Signalstärke (Fläche des schwächeren Signals). © Mit freundlicher Genehmigung von Dr. Hans Mol (RIKILT)

Diese Regelung geht davon aus, dass es einen Zusammenhang zwischen der auftretenden Abweichung und dem relativen Intensitätsverhältnis der MRM-Übergänge gibt. Wie die experimentellen Messungen in Bild 3 allerdings deutlich zeigen, ist diese angenommene Abhängigkeit nicht zutreffend, und sie konnte auf keinem der fünf Geräte von unterschiedlichen Herstellern bestätigt werden.

Vielmehr liegt der Schluss nahe, dass die absolute Signalhöhe den Haupteinfluss auf die Schwankungen der Ion Ratios ausübt. Da starke Signale natürlich viel stabiler sind, als verrauschte Messungen nahe der Nachweisgrenze, erscheint dieser Zusammenhang mehr als plausibel.

Plottet man die relative Abweichung des MRM-Signalverhältnisses gegen die Fläche des schwächeren Produkt-Ions, bestätigt sich, dass die Signalstärke (Response) der dominierende Faktor bei der Ion Ratio-Abweichung ist (Bild 4). Bei guten Signalqualitäten beider Übergänge ist das MRM-Verhältnis sehr stabil, und zwar unabhängig vom Intensitätsverhältnis der Übergänge, und die Signalverhältnis-Abweichungen sind dann auch relativ gering. Im Gegensatz zu bestimmten Vorgaben (USDA PDP), welche die Signalverhältnis-Toleranz als Absolutwert definieren, müssen Ion Ratio-Toleranzen relativ definiert werden.

Tabelle: Vergleich von MS/MS-Identifizierungskriterien der Regulatorien in der organischen Schadstoffanalytik und der Dopinganalytik bezüglich der Toleranzen für die Ionenverhältnisse (RI: relative Intensität von zwei MRM-Übergängen) [1].

Besonders bei Realproben (blaue Punkte in Bild 3 und 4) werden die Ion Ratio-Abweichungen vom Signal/Rausch-Verhältnis (S/N) der Ionenspuren dominiert. So waren rund 80 % der Verhältnis-Differenzen innerhalb der ±20 %-Grenze zu finden (Bild 4, Tabelle). Weniger als 2 % wiesen Abweichungen von über 50 % auf, diese jedoch allesamt im Bereich der sehr kleinen Peaks (d.h. niedrige S/N).

Grundsätzlich darf die Bedeutung der Auswahl von möglichst selektiven bzw. spezifischen Ionen nicht unterschätzt werden. Precursor-Ionen unter 100 Da und MRM-Fragmente, die durch Abspaltung von Wasser oder gemeinsamer Gruppen entstehen, sind ungeeignet. Für die Ratio-Überprüfung sind nur chromatographische Peaks aus MRM-Aufnahmen bzw. EIC (Extracted Ion Chromatogram) zulässig. Ein simpler Vergleich der m/z-Abundance aus Einzel-Scans od. Spektren ist keinesfalls ausreichend, da auch die Peakformen und die zeitgleiche Überlappung zusammengehörender Ionenspuren-Peaks zu überprüfen sind.

Falsch-negativ vs. falsch-positiv
Beim Nachweis von diversen Schadstoffen muss besondere Sorgfalt zur sicheren Identifizierung der Zielanalyten angewandt werden. Wird eine Substanz fälschlicherweise detektiert, obwohl sie tatsächlich nicht vorhanden ist, spricht man von falsch-positiver Identifizierung. Das kann schwerwiegende rechtliche Konsequenzen für einen Beschuldigten haben und hohe Kosten nach sich ziehen. Schwer zu beziffern ist der Schaden, der durch falsch-negative Ergebnisse entstehen kann, zumal es mit gesundheitlichen Schädigungen verbunden sein kann, wenn Schadstoffe irrtümlich nicht erkannt werden. Beide Fehler lassen sich in der rückstandsanalytischen Praxis nie völlig ausschließen, da z.B. die nachzuweisenden Konzentrationen von organischen Schadstoffen oft extrem niedrig sind und sicher von einer unüberschaubaren Vielzahl von Störstoffen mit vergleichsweise exorbitant hohen Anteilen unterschieden werden müssen.

Grundsätzlich wurde durch die umfangreichen Experimente wieder einmal bewiesen, dass LC-MS/MS Systeme auch bei geringem Clean-up-Aufwand hochselektive Bestimmungsmethoden ermöglichen.

Wie zu erwarten, sinkt der Anteil an falsch-negativen Resultaten mit breiter werdender Toleranz für das Ionenverhältnis. Wenn jedoch die beiden MRM-Spuren mit guter Qualität erfassbar sind (hohes S/N), hat das Toleranzausmaß nur mehr einen geringen Einfluss auf die falsch-negative Rate.

Die Ion Ratio-Toleranz spielt aber eine große Rolle, wenn beide oder auch nur ein Übergang schlecht messbar ist (schwaches Signal, hohes Rauschen, etc.). Diesbezüglich sind positive Auswirkungen zu Gunsten eines guten, dominierenden Signals primär von einer guten Ionisierungs-Effizienz und einer hohen Sensitivität des MS/MS-Systems zu erwarten. Wenn die Absolutmenge an Ziel- analyten hoch ist, nur geringe Ionenunterdrückung bzw. wenig Ion-Enhancement auftritt und grundsätzlich die Selektivität der Produkt-Ionen sehr gut ist, wird auch die Qualität der Signale profitieren.

Deshalb sind großzügigere Toleranzen vorteilhaft, wenn bei geringen S/N eine Reduktion von falsch-negativen Ergebnissen erzielt werden soll. Bei zu großzügigen Ion Ratio-Toleranzen steigt allerdings auch die Gefahr für falsch-positive Identifizierungen an.

Ion Ratio-Kriterium
Das angestrebte Ziel sollte sein, dass falsch-positive Befunde stark minimiert bzw. idealerweise eliminiert werden, und dass die falsch-negativen zumindest akzeptabel gering gehalten werden, das heißt, zumindest unter 5 % bleiben.

Um der Frage nachzugehen, welche Übereinstimmungen zwischen MRM-Verhältnissen von Lösungsmittel-basierten Kalibrier-Standards und jenen von Realproben-Extrakten in der Routinepraxis erwartet werden dürfen, wurden von Dr. Mol verschiedenste statis-tische Betrachtungen durchgeführt, auf die hier aus Platzgründen nicht näher eingegangen werden kann.

Letztlich ergibt sich aus dem umfangreichen Datenmaterial vom Idealfall bis zum „worst case“ ein Toleranzbereich von circa ±21... ±45 %.

Damit ist auch die aktuellste Abänderung des SANCO-Dokuments für die Pestizid-Analytik zu erklären, bei dem die tolerierbare Abweichung für LC-MSn, LC-MS, GC-MSn, GC-CI-MS mit 2014 grundsätzlich auf ±30 % fixiert wurde (SANCO/12571/2013 vs. SANCO/12495/2011).

Die Festlegung von diagnostischen Parametern, wie die Retentionszeit und das Ionenverhältnis mittels reiner Referenzsubstanzen und deren Vergleich mit der Messung von Realproben unter Anwendung der erläuterten Toleranzen als Leitlinie, ist ein sehr gut geeigneter Ansatz für die relativ sichere Identifizierung von Schadstoffen.

Trotzdem ist immer noch sowohl die technische Expertise des Anwenders notwendig als auch die entsprechende Erfahrung mit der Methodik und den unterschiedlichen Matrizes sehr gefragt. Im Gegensatz zu einem unerfahrenen Analytiker oder einer automatischen Software-Entscheidung, die lediglich rein numerische Vergleiche von Soll und Ist unter Berücksichtigung der Toleranzen anstellt, wird ein erfahrener Entscheider auch die Plausibilität der Ergebnisse im Kontext mit dem rechtlichen Umfeld und den Matrix-Erfahrungen entsprechend berücksichtigen. Die Konsequenzen für falsch-positive bzw. falsch-negative Ergebnisse sind bei der endgültigen Entscheidung über eine unklare Identifizierung ebenso mit einzubeziehen, wie das Wissen um die Stärken und insbesondere um die Schwächen der Gesamtmethode bei schwierigen Matrizes (Validierung).

Unter bestimmten Umständen muss auch von Fall zu Fall differenziert vorgegangen werden. Fragliche oder unplausible Ergebnisse müssen kritisch hinterfragt und gegebenenfalls mit alternativen bzw. orthogonalen Methoden verifiziert werden. Ebenso sind zusätzliche MRM-Übergänge und Spektren, unterschiedliche Chromatographie-Bedingungen, etc. oder letzten Endes auch der Einsatz der hochauflösenden Massenspektrometrie geeignet bzw. sogar notwendig, um zu einem höheren Sicherheitsgrad bei der Identifizierung zu gelangen.

Fazit und Empfehlungen
Die Retentionszeit-Variationen sind unabhängig von der Retentionszeit, und daher ist die Toleranz als absoluter Wert wie z.B. ±0,1 bzw. ±0,2 min zu definieren.

Die Variation der Ionenverhältnisse hängt hauptsächlich von Signal/Noise der Produkt-Ionen ab und nicht, wie in einigen Regulatorien angenommen, vom relativen Verhältnis der beiden Signale. Daraus folgt, dass eine konstante Abweichung in Prozenten des Referenz-Ionenverhältnisses (Mittelwert aller LM-Kalibrierstandards derselben Sequenz) zu definieren ist. Mit ±45 % Toleranz sollte der Großteil der bei praktischen Proben auftretenden Variationen abgedeckt sein. Da in der Versuchsanordnung damit auch keine nachweisbaren falsch-positiven Ergebnisse in Blank-Extrakten aufgetreten sind, kann ein Toleranzbereich von ±45 % als „Fit for Pur- pose“ gelten. Die neueste Pestizid-Regelung legt ±30 % (sowie ±0,2 min für die Retentionszeit) fest, was derzeit auch für zukünftige Mykotoxin-Vorgaben propagiert wird.

Im ungeregelten Bereich, d.h. wenn keine vorgegebenen, gesetzlichen Regulatorien bestehen, kann folgende Vorgehensweise empfohlen werden:

  • Das chromatographische Erkennungsfenster sollte ein absoluter Wert im Bereich von ±0,1...0,2 min sein.
  • Alle MRM-Peaks liegen zeitlich exakt übereinander und die Signalstärke liegt über dem Reportinglimit.
  • Vergleich der relativen Intensität der beiden Produkt-Ionen mit dem Referenzwert für das Soll-Ionenverhältnis.
  • Bei Ion Ratio-Abweichungen von über 30 % sollte eine Überprüfung auf eventuelle Interferenzen, Artefakte, etc. stattfinden, da durch solche Störungen nicht nur die Identifizierungssicherheit geringer wird, sondern auch die Quantifizierung beeinträchtigt sein kann.

Literatur
[1]
Steven J. Lehotay, Yelena Sapozhnikova, Hans G.J. Mol, „Current issues involving screening and identification of chemical contaminants in foods by mass spectrometry“; TrAC Trends in Analytical Chemistry, Volume 69, June 2015, Pages 62–75.
[2] H.G.J. Mol, et al., „Identification in residue analysis based on liquid chromatography with tandem mass spectrometry: Experimental evidence to update performance criteria“; Analytica Chimica Acta 2015; Volume 873, 11 May 2015, Pages 1–13.
[3] H.G.J. Mol, et al., „Identification criteria for determination of mycotoxins in food and feed“; EURL-workshop mycotoxins, Geel, 15-16 October 2014.

Wolfgang Brodacz; AGES Österreichische Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit Lebensmittelsicherheit – Kontaminantenanalytik

Wolfgang Brodacz
AGES Österreichische Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit Lebensmittelsicherheit – Kontaminantenanalytik
4020 Linz
E-Mail: wolfgang.brodacz@ages.at

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