Hormone in Oberflächengewässern

LC-MS/MS-Methode zur Erfüllung der Umweltqualitätsnorm für die Steroide Estron, 17-β-Estradiol und 17-α-Ethinylestradiol

Hormone und hormonell wirksame Substanzen sind im täglichen Leben allgegenwärtig – nicht immer rühmlich, etwa in der Tierzucht und –haltung oder als Dopingsubstanzen im Sport. Sie werden aber auch in der Medizintherapie genutzt oder als Verhütungsmethode. Nach ihrer Anwendung gelangen diese biologisch hochpotenten Moleküle als Jauche auf die Felder und schließlich ins Grundwasser oder über das Abwasser via Klärwerk in Flüsse und Seen.

Mit Hormonen kontaminiertes Wasser stört nachweislich das Sexualverhalten und die Fortpflanzung von Fischen und anderer aquatischer Organismen. So konnte die Verweiblichung männlicher Fische und Amphibien durch hormonell wirksame Verbindungen bereits nachgewiesen werden [1,2,3].

Beunruhigender als das sind jedoch mögliche schädliche Auswirkungen auf den menschlichen Organismus, da die Hormone direkt über unser Trinkwasser oder indirekt über die Nahrungskette aufgenommen werden können. Noch sind die Langzeitwirkungen auf den Menschen nicht final geklärt. Die Überwachung unserer Gewässer in Bezug auf hormonell aktive Substanzen erscheint daher als ratsam.

Auf der Beobachtungsliste
Dementsprechend hat die EU das weit verbreitete Estron (E1), 17-β-Estradiol (E2) sowie sein synthetisches Analogon 17-α-Ethinylestradiol (EE2), das hauptsächlich zur oralen Kontrazeption verwendet wird, auf die im Jahr 2013 eingeführte Beobachtungsliste der europäischen Wasserrahmenrichtlinie gesetzt [4]. Bedingt durch die hohe Wirksamkeit dieser Stoffe in niedrigsten Dosierungen wurden Umweltqualitätsnormen, ausgedrückt als Konzentrationen, festgelegt, die trotz modernster Technik eine analytische Herausforderung bedeuten. So fordert die europäische Wasserrahmenrichtlinie, umgesetzt in der deutschen Oberflächengewässerverordnung für E1 und E2 eine Nachweisgrenze von 0,4 ng/l, bzw. für EE2 sogar 0,035 ng/l [5]. Dies entspricht einer handelsüblichen Antibabypille in ca. 500 Mio. Litern Wasser.

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Tabelle 1: Zusammenfassung der Ergebnisse für E1, E2 und EE2 bei einem Injektionsvolumen von 1,2 ml; *INF = Rauschen gleich Null; S/N nicht berechenbar; # [5].

Zur konkreten Umsetzung der Direktive 2013/39/EU in Bezug auf E1, E2 und EE2 evaluierte das Joint Research Center (JRC) der Europäischen Kommission daher mehrere Literaturmethoden, die zumeist eine Festphasenextraktion (solid phase extraction – SPE) von 1 l Wasser auf 1 ml vorsehen [6]. Die so angereicherten Proben wurde anschließend mittels LC-MS/MS selektiv und sensitiv analysiert, wobei mit der sensitivsten Methode [7] die Bestimmungsgrenze von 0,035 ng/l für EE2 nur in Reinstwasser, nicht aber in Oberflächenwasser erreicht wurde. Das JRC validiert folglich eine Methode zur Anreicherung von einem Liter Wasser auf 100 µl, um die Nachweisgrenze für EE2 zu erreichen [8].

LC-MS/MS-Methode mit Mehrfachdirektinjektion
Um die Steroidhormone in Oberflächenwasser gemäß Umweltqualitätsnorm zu messen, wurde eine LC-MS/MS-Methode mit Mehrfachdirektinjektion (stacked injection) auf der Shimadzu Nexera X2 UHPLC-Anlage (binär, hochdruckmischend) entwickelt, gekoppelt an ein LCMS-8060 Triple-Quadrupol-Massenspektrometer (Bild 1). Das LCMS-8060 ist das neueste und empfindlichste Massenspektrometer von Shimadzu. Verglichen mit dem Vorgängermodell LCMS-8050, hat das LCMS-8060 zwar auch die bewährten Ultra-Fast-Mass-Spectrometry-Technologien und die beheizte ESI-Quelle, aber darüber hinaus auch einen weiterentwickelten Ioneneinlass sowie ein verbessertes Vakuumsystem, so dass die Sensitivität des Geräts im Schnitt etwa um einen Faktor drei höher ist.

Die hier beschriebene LC-MS/MS-Methode wurde für die Quantifizierung von Estron, Norethisteron, Mestranol, Estriol, 16-α-Hydroxyestron, 17-β-Estradiol und 17-α-Ethinylestradiol in Oberflächengewässern und Trinkwasser entwickelt. Hierzu wurden methanolische Kalibrierstandards sowie dotiertes Rhein- und Bachwasser vermessen.

Bild 1: LCMS-8060 Triple-Quadrupol-Massenspektrometer, gekoppelt an eine Nexera X2 UHPLC (Shimadzu).

Im ersten Ansatz wurden insgesamt 1200 µl (6 x 200 µl) mit dem stacked-injection-Modus injiziert. Hierbei wird die Autosampler-Nadel aus dem Fluss geschaltet, um die Probe aufzuziehen, und in den Fluss zurückgeschaltet, um zu injizieren (Bild 2). Die Einzelinjektionen werden auf dem Säulenkopf fokussiert, und nach beendeter Auftragung werden durch Start des Gradienten die Analyten von der stationären Phase eluiert und chromatographisch getrennt.

Die Trennung der Steroide erfolgte auf einer C18-Phase. Die chromatographische Separation wurde mit einem 22-minütigen binären Gradienten bei einem Fluss von 0,3 ml/min erreicht. Alle genannten Steroide lassen sich voneinander trennen und massenspektrometrisch quantifizieren. Die Ergebnisse für E1, E2 und EE2 sollen hier näher beleuchtet werden.

Analysenergebnisse
Estron wurde anhand der Massenübergänge 269,20>145,10 und 269,2>159,15 bestimmt und nachgewiesen, Estradiol anhand der Übergänge 271,00>183,20 und 271,10>145,20 sowie 17-α-Ethinylestradiol anhand der Übergänge 295,20>269,20 und 295,20>145,05.

Bild 2: Schematische Darstellung der stacked-injection-Methode.

Estron (E1), 17-β-Estradiol (E2) und 17-α-Ethinylestradiol (EE2) wurden in einem linearen Konzentrationsbereich von 0,05 ng/l bis 100 ng/l quantifiziert. Die Regressionskoeffizienten r² betrugen 0,9990 für E1, 0,9930 für E2 und 0,9948 für das EE2. Die Genauigkeiten lagen zwischen 91 % und 115 %.

Sechs konsekutive Messungen des 1 ng/l Kalibrierstandards belegen die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse für alle drei Steroide mit Variationskoeffizienten von 5,1 % für Estron, 8,8 % für 17-β-Estradiol und 12,9 % für 17-α-Ethinylestradiol. Die Ergebnisse für alle drei für die Umweltqualitätsnorm relevanten Steroide sind in Tabelle 1 zusammengefasst.

Die entwickelte Methode ist für E1 und E2 absolut ausreichend. Lediglich für EE2 wird die geforderte höchstzulässige Nachweisgrenze der Methode von 0,035 ng/l knapp verfehlt. Die Aufkonzentrierung von 1,2 ml Probenwasser über die stacked-injection-Methode reicht hierbei nicht gänzlich aus. Weitere Versuche zeigten, dass eine Erhöhung des Injektionsvolumens nicht mehr möglich ist, da die Beladungskapazität der verwendeten Säule erreicht wurde. Um EE2 im Bereich der geforderten Nachweisgrenze zu detektieren, könnte eine leichte Aufkonzentrierung um den Faktor 2...5 zielführend sein.

Tabelle 2: ]. Zusammenfassung der Ergebnisse für E1, E2 und EE2 bei der Anreicherung von 1000 ml Probenvolumen auf 1 ml. Wiederfindung in [%].

Anreicherung von 1000 ml Wasserprobe
Ein weiterer verbreiteter Ansatz ist die eingangs erwähnte Aufkonzentrierung von 1 l Wasserprobe. Die Probe wurde hier mit stabilisotopen-markiertem internem Standard versetzt, mit den Hormonen dotiert und auf eine konditionierte C18-SPE-Kartusche gegeben. Diese wurde mit Methanol gewaschen, die Analyten mit Methanol eluiert abgedampft und in 1 ml Reinstwasser aufgenommen. Wird dieser Extrakt direkt injiziert, ist die Signalsuppression durch angereicherte Matrixbestandteile sehr stark. In einem nächsten Schritt wurde daher der methanolische Extrakt mit einer weiteren Normalphasen-Kartusche aufgereinigt. Der so behandelte Extrakt wurde wiederrum bis zur Trockne eingeengt und in 1 ml Reinstwasser für die Direktinjektion aufgenommen. Mit einem Injektionsvolumen von 50 µl wurde der Bereich 0,00225 – 22,5 ng/l, bezogen auf 1 l Probe, mit Korrelationskoeffizienten zwischen 0,9785 und und 0,9969 kalibriert. Je zwei Proben von Oberflächengewässern und Kläranlagenablauf wurden an verschiedenen Stellen entnommen, mit 1 ng/l dotiert und wie beschrieben aufgearbeitet. Die resultierenden Wiederfindungen, abzüglich der in den Proben enthaltenen Analyten, sind in Tabelle 2 zusammengefasst.

Die Aufkonzentrierung von 1 l Probe führt zu besonders hoher Matrixbelastung in der Injektionslösung. Für eine bessere Abtrennung von Analyt und Matrix können alternative Techniken wie zum Beispiel Varianten von Molecularly imprinted polymers (MIP) zur molekülspezifischen Anreicherung der Zielverbindungen getestet werden. Bei der chromatographischen Trennung führen lange Gradienten mit langen Säulen und kleinen Partikeln zu einer besseren Abtrennung zwischen Analyt und Matrix. So wird zum Beispiel bei der Chromatographie von EE2 ein Störpeak effizient vom Analytsignal abgetrennt.

Fazit
Die Mehrfachdirektinjektion ist ein nützliches Werkzeug bei der Injektion großer Volumina. Hierdurch ergibt sich eine Möglichkeit, zukünftig auf noch anspruchsvollere Nachweisgrenzen von Umweltkontaminanten durch eine Erhöhung des Probenvolumens zu reagieren, ohne dabei grundsätzlich die Methodik oder das Messsystem selbst erneuern zu müssen.

Literatur
[1] Aris, A. Z. et al.: Environment International, 69, 104–119 (2014).
[2] Pal, A. et al.: Science of the Total Environment 408 (24), 6062–6069 (2010).
[3] Tamschick, S. et al.: Scientific Reports 6: 23825 (2016).
[4] Richtlinie 2013/39/EU des europäischen Parlamentes und des Rates.
[5] Durchführungsbeschluss (EU) 2015/495 der Kommission, Aktenzeichen C(2015) 1756.
[6] Loos, R.: Analytical methods for possible WFD 1st watch list substances, JRC Science and Policy Report, EUR 27046 EN.
[7] Williams, R. et al.: Environ. Toxicol. Chem. 31 (4), 892–898 (2012).
[8] Tavazzi, S. et al.: Validation report according to ISO 17025 requirements, JRC Technical Reports, EUR 27813 EN.

Dr. Davor Turkovic
Jan Stenzler
Shimadzu Deutschland GmbH
Duisburg
E-Mail: info@shimadzu.de

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