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Die Evolution der Fragmentierungstechniken - „Knackpunkte“ der Massenspektrometrie

TOC-Geräte von Analytik JenaGarantie erweitert, Farbdesign neu

TOC-Geräte von Analytik Jena: Garantie erweitert, Farbdesign neu

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Die Evolution der Fragmentierungstechniken„Knackpunkte“ der Massenspektrometrie

Obwohl beim Begriff Fragmentierung etwas Destruktives mitschwingt, steht er in der Massenspektrometrie für puren Informationsgewinn. Erst die Zerschlagung von intakten Molekülen und die Ionisierung der Bruchstücke gibt ihre Identität preis. Der Rückschluss von den Teilen auf das Ganze entspricht dem Wesen der Massenspektrometrie. 

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Die Evolution der Fragmentierungstechniken: „Knackpunkte“ der  Massenspektrometrie

Die zerstörungsfreie Gewinnung von molekülspezifischen Informationen zur Identifizierung von Analyten bei der Chromatographie ist im nennenswerten Umfang nur mit optischen Diodenarray-Detektoren möglich. Nicht nur, dass die Spektralunterschiede oft unspezifisch sind, ist diese Technik der HPLC vorbehalten und grundsätzlich auf Substanzen beschränkt, welche chromophore Strukturen mit delokalisierbaren Elektronen besitzen.

Die Massenspektrometrie (MS) hingegen ist für alle chromatographischen Trennmethoden geeignet und gilt als universelles Detektionsverfahren. Voraussetzung ist allerdings die Ionisierbarkeit der Analyten und für eindeutige Identifizierungen auch die Fragmentierung in charakteristische Bruchstücke.

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Die MS mit dem kostengünstigen Analysa-tortyp Quadrupol ist in der Gaschromatographie praktisch zum Standard-Detektionsverfahren geworden. Sie verdrängt damit immer mehr die klassischen selektiven Detektoren wie ECD, NPD, etc.

Electron-Impact-Ionenquelle

Isolierung + Fragmentierung: Elektronenbeschuss (EI)
Der Hauptvorteil der Massenspektrometrie, der zum Siegeszug dieser Technik beigetragen hat, ist die enorme Flexibilität, die es dem Anwender ermöglicht, die Selektivität des Detektors optimal an die Analyten anzupassen. Gefördert wurde dieses rasche Wachstum in der GC-MS durch das für den Anfänger sehr einfach zu handhabende Ionisationsverfahren EI (Electron Impact, Elektronenstoß) und die Standardisierung der Ionisationsenergie (70 eV), die damit auf praktisch allen Geräten verschiedener Hersteller informationsreiche und sehr ähnlich Spektren gewährleistet. Das ebnete sehr schnell den Weg für systemübergreifend verwendbare MS-Spektrenbibliotheken, die wiederum Screening-Verfahren in der GC-MS sehr attraktiv machten.

Die Ionisierung durch Elektronenstoß mit einer Energie von 70 eV ist in der GC-MS daher zum Standardverfahren geworden. Der seit Jahrzehnten festgelegte Standard liegt wesentlich über der für die Ionisierung von flüchtigen organischen Molekülen notwendigen Energie (meist unter 13 eV). Neben einer Optimierung der Signalintensität ist die Vergleichbarkeit von Spektren das Hauptziel der Vereinheitlichung.

Als Elektronenquelle dient eine Glühkathode in Form eines geheizten Wolfram- oder Rhenium-Drahtes (Filament in Bild 1). Die emittierten Elektronen durchlaufen ein Potenzialgefälle von meist 70 V, werden dabei beschleunigt und prallen schließlich mit entsprechend hoher Energie auf die Analyten, die als Neutralteilchen (gelb) aus der Kapillarsäule in den Vakuumbereich eluieren. Um einen möglichst intensiven Kontakt zu begünstigen, werden von manchen Herstellern mittels Magnetfeldern die Elektronenbahnen spiralförmig durch den Eluentenstrom geführt (Bild 1, links). Solange die eluierten Analyten in der Ionenquelle dem Elektronenbombardement ausgesetzt sind, tritt der energiereiche Elektronenstrahl mit den äußeren Elektronen des Moleküls in Wechselwirkung. Die stattfindende Energieaufnahme geht mit der Abspaltung eines Elektrons und der Bildung des Molekülions Meinher. Die zur Ionisierung aufzuwendende Mindestenergie entspricht der Energie, die notwendig ist, um das Elektron aus dem höchsten besetzten Orbital zu entfernen. Die Überschussenergie im Molekül führt zu Rotationen und Schwingungen von Molekülteilen und schließlich zur Fragmentierung. Ihr Ausmaß ist abhängig von der Fähigkeit der Struktur, sich zu stabilisieren. Oft folgen intensive Fragmentierungsreaktionen, welche die Anzahl der M+-Ionen reduzieren und die Bildung von stabilen Fragmenten fördern. Der auf Plus-Potenzial gesetzte sog. Repeller sorgt dafür, dass die positiv geladenen Molekülionen und Fragmente (in Bild 1, rechts, bunt dargestellt) sofort aus der Ionenquelle in den Quadrupol-Massenanalysator transferiert werden. Für eine ausreichende sog. mittlere freie Weglänge muss die ca. 200 bis 300 °C heiße Ionenquelle auf 10-2 bis 10-6 mbar Restdruck evakuiert werden.

EI-Fragmentierung in der GC-MS

Bild 2 zeigt im Vergleich zur weichen Fragmentierungsmethode in der LC-MS/MS (unten) die starke Fragmentierung des silylierten Mykotoxins Fusarenon X bei Elektron Impact in der GC-MS. Das Molekülion (M+) bei Masse 570 zerfällt fast vollständig in eine große Anzahl von Fragmenten (oben schwarz), deren wichtigste Spezies in der Ausschnittsvergrößerung (oben rechts) interpretiert sind. Die drei OH-Gruppen von Fusarenon X müssen zur Erhöhung der Flüchtigkeit für die GC mittels Silylierung zu Trimethylsilyl-Gruppen (oben) umgesetzt werden. Das dominanteste Ion (73) im EI-Spektrum ist charakteristisch für silylierte Substanzen und entspricht diesen abgespaltenen Trimethylsilyl-„Schirmchen“.

Die Fragmentierungs- und Umlagerungsvorgänge sind weitgehend bekannt und werden in Form von Fragmentierungsregeln zur manuellen Interpretation von Massenspektren bzw. zur Identifizierung unbekannter Substanzen eingesetzt.

Fragmentierung erhöht einerseits den Informationsgehalt von EI-Spektren, reduziert aber andererseits die Ionenintensität des Molekülions.

In-Source-Fragmentierung

Chemische Ionisation mit schwacher Fragmentierung (CI)
Unter der chemischen Ionisation (CI) versteht man im Gegensatz zur EI eine weiche Ionisationstechnik, die unter Vermittlung eines Reaktandgases in Form einer exothermen chemischen Reaktion in der Gasphase abläuft. Dazu wird im Prinzip eine EI-Ionenquelle verwendet, die etwas geschlossener ausgeführt ist, um das eingespeiste Reaktandgas (1000 bis 10 000 facher Überschuss) bei höherem Druck (d.h. geringeres Vakuum im Bereich von 0,1 bis 1 mbar) in intensiven Kontakt mit den Analytmolekülen zu halten. Der Elektronenbeschuss des Reaktandgases generiert in Primärreaktionen reaktive Reaktandgasionen, welche dann mit den neutralen Zielanalyten über Stoßreaktionen in der Gasphase zu stabilen positiven oder negativen Ionen umsetzen. Meist entstehen durch Protonierung positiv geladene Quasimolekülionen [M+H].

Mit Hilfe von Gasen wie z.B. Methan, Isobutan oder Ammoniak wird somit im Vergleich zur EI weniger Energie zur Ionisierung übertragen, wobei stabile Molekülionen bzw. Anlagerungsprodukte mit hoher Intensität entstehen. CI-Spektren weisen weniger oder keine Fragmente auf und geben daher in der Regel auch eine bessere Information über das Molekulargewicht. Dies kann bei der Strukturaufklärung zur Ermittlung oder Bestätigung von Molekülgewichten hilfreich sein. Durch gezielte Nutzung der CI-Reaktionen bestimmter Reaktandgase kann eine zusätzliche Selektivität erreicht werden. Quantifizierungen können nicht nur selektiv, sondern auch sehr empfindlich und durch die Wahl einer Quantifizierungsmasse im Molekülgewichtsbereich ungestört von der niedermolekularen Matrix durchgeführt werden.

Während die GC-MS schon lange von der robusten, kostengünstigen und einfach zu bedienenden EI-Ionenquelle profitiert, haben vergleichbare Techniken in der LC-MS lange auf sich warten lassen bzw. sind noch immer nicht in gleichem Maße gegeben. Das ist auch nicht verwunderlich, denn es ist technisch viel einfacher realisierbar, einen Gasfluss von 1 ml/min so abzupumpen, dass ein für die MS notwendiges Hochvakuum aufrechterhalten bleibt, als 1 ml Flüssigkeit/min. Aus 1 ml Wasser entstehen 1673 ml Wasserdampf, d.h. bei üblicher LC-Eluentenzusammensetzung muss das System zumindest mit der 1000-fachen Gasmenge fertig werden.

Vergleich der In-Source-Fragmentierung

Besonders der schwierige Entwicklungsprozess zu routinetauglichen Ionisationstechniken mit etlichen Irrwegen und Alleingängen der Hersteller hat die Verbreitung der LC-MS anfänglich stark verzögert. Der Durchbruch kam erst mit der Entwicklung der API-Techniken (Atmospheric Pressure Ionisation) wie ESI (Elektrospray Ionisation), APCI (Atmospheric Pressure Chemical Ionisation) und APPI (Atmospheric Pressure Photo Ionisation), welche die MS auch in der HPLC salonfähig gemacht haben. Seither verzeichnet die LC-MS steile Zuwachsraten bei den Marktanteilen und große Steigerungen bei Publikationen. 

In-Source-Fragmentierung
Während in der Kapillar-GC die hohe chromatographische Trennleistung die Identifizierungssicherheit sehr gut unterstützt, muss in der HPLC die Massenspektrometrie die Defizite des vergleichsweise geringen LC-Trennvermögens kompensieren.

Außerdem kommt erschwerend hinzu, dass die weichen API-Ionisationsverfahren der HPLC kaum Fragmente hervorbringen. Bei den relativ kostengünstigen MS-Detektoren mit Single Quadrupolen (Q oder SQ) erhält man in der HPLC daher im Normalfall ein relativ dominantes Signal im Bereich der Molekülmasse (meist positive M+H oder negative M-H Ionen). Das ist zwar erfreulich für die Sensitivität, lässt aber Strukturinformationen vermissen.

„MRM3“-Experiment

Daher musste eine Technik speziell für die LC-Kopplung entwickelt werden, die im Anschluss an die weiche Ionisation, d.h. im Übergangsbereich zwischen Normaldruck und dem Hochvakuum des Quadrupols (Bild 3), nachträglich so viel Energie auf die großen Moleküle überträgt, dass sie zur Fragmentierung gezwungen werden können. Bei dieser sog. In-Source-Fragmentierung werden die Ionen im ersten Vakuumbereich vor dem Hochvakuum durch Anlegen einer Spannung an die Transferkapillare beschleunigt und damit ihre kinetische Energie erhöht. Gleichzeitig werden in diesem Bereich neutrale Moleküle (z.B. Stickstoff aus dem sog. Skimmer) in die Flugbahn eingespeist, die zu heftigen Zusammenstößen führen. Die freiwerdende Kollisionsenergie, d.h. die Umwandlung der kinetischen Energie in Schwingungsenergie, spaltet die großen Ionen in charakteristische Bruchstücke (Collision Induced Dissociation, CID). Das Ausmaß der übertragenen Energie kann über die Spannung gut geregelt werden.

Die Zerschlagung in viele Fragmente hat aber den Nachteil, dass dominante (Quasi-)Molekülsignale zu Gunsten des Informationsgewinns geopfert werden müssen. Die CID der In-Source-Fragmentierung erhöht zwar durch fragmentreiche Massenspektren die Identifizierungssicherheit, reduziert aber auch im selben Maße die Nachweisempfindlichkeit durch viele kleine Bruchstücke geringerer Intensität. Und es gehen auch viele Analytionen im Stickstoffstrom verloren. Außerdem verbraucht der dafür notwendige breite Scan-Bereich mehr Messzeit, d.h. die für die Sensitivität maßgebliche Dwell Time (Verweilzeit pro Ion) verteilt sich auf einen großen Massenbereich. Daher sind Single-Quadrupol-Massenspektrometer in der LC-MS bei mittleren Probenkonzentrationen zwar optimal an die Zielanalyten anpassbar und damit nachweissicher, aber nicht für die Rückstandsanalytik geeignet. Bei dieser einfachen und noch relativ kostengünstigen MS-Konfiguration muss man sich letztlich immer zwischen Sensitivität und Informationsgehalt entscheiden.

Ein wesentlicher Nachteil der In-Source-Fragmentierung ist auch die Entstehung von Mischfragment-Spektren. Eluieren zwei Substanzen gemeinsam aus der HPLC-Säule (blauer u. schwarzer Pfeil in Bild 4, links oben), werden beide simultan in gleichem Maße von der unspezifischen In Source-CID fragmentiert. Der Quadrupol-Massenanalysator Q1 regis-triert im Scan alle Fragmente, ohne zwischen den Analyten unterscheiden zu können. 

QqQ – die High-Tech- Fragmentierung
Um diesen technisch bedingten Zielkonflikt und andere Nachteile der Single Quads zu entschärfen, wurde die Tandem-Konfiguration entwickelt, indem sie um eine weitere MS-Stufe erweitert wurde („Tandem in Space“). Die „Tandem in Time“-Technik würde sogar, zeitlich gestaffelt, wiederholbarere Fragmentierungen und theoretisch mehrere MS-Stufen ermöglichen. Diese Variante soll hier aber nicht weiter behandelt werden, da sie nur mit 3D-Ionenfallen funktioniert. Diese auch Ion Traps genannten Massenanalysatoren waren einmal wegen ihrer kostengünstigen Bauart beliebt, konnten sich aber für Quantifizierungen am Analytikmarkt nicht durchsetzen.

Für die serielle Kombination von zwei MS-Analysatoren war anfänglich der bewährte Quadrupol die optimale Wahl. Für eine gezielt gesteuerte CID musste dazwischen noch eine Stoßzelle, meist auch in Form eines weiteren Quadrupols (teilweise auch als Hexapol ausgeführt) implementiert werden (Bild 4, unten, Q2). Daraus resultierte dann der Begriff „Triple Quad“ (QQQ bzw. QqQ).

Damit war es erstmals möglich, „sortenrein“ zu fragmentieren (Bild 4, unten). Durch die technisch aufwendigere Lösung kann im ersten Quadrupol Q1 ein einziges sog. Vorläuferion (Precursor Ion), meist das Quasimolekülion (z.B. das negative M-H bzw. positive M+H wie in Bild 2, unten) selektiv ausgewählt werden. Nur diese Spezies (Bild 4, unten; schwarzer Pfeil) gelangt dann gezielt in die Stoßzelle Q2 und wird unter genau definierten CID-Bedingungen fragmentiert. Dieser Bereich ist von einer Zelle umschlossen, in die das Stoßgas (Stickstoff oder auch das schwerere Argon) zudosiert wird. Die exakte Steuerung der eingebrachten Energie in Form der CID-Spannungen bestimmt den Grad der Fragmentierung des Quasimoleküions. Bild 2 zeigt im unteren Teil den im Vergleich zur EI wesentlich weicheren Charakter der CID-Aufspaltung.

Durch das Einschießen der aus dem Q1 austretenden Precursor-Ionen kommt es zu niederenergetischen Kollisionen (ca. 10 bis 40 eV) in der Stoßgas-Wolke von Q2. Die Ionen werden so stark zur Vibration angeregt, dass sie zerbrechen (CID) und charakteristische Bruchstücke bilden, die im dritten Quadrupol Q3 (zweite MS-Stufe) erfasst werden und das sog. Produktionenspektrum bilden (Product Ions). Sofort anschließend (in Millisekunden) kann Q1 auf den nächsten Precursor (z.B. blauer Pfeil) fokussiert werden, wodurch für jede Spezies sortenreine Produktionen-Massenspektren generiert werden. Die Differenzierung von Co-Eluierenden gelingt so mit hoher Identifizierungssicherheit.

Serielle Fragmentierung
Später wurde von einem Hersteller auch die Tandemkonfiguration von einem Quadrupol mit einer linearen Ionenfalle (LIT) unter der Bezeichnung QTRAP etabliert, welche sich durch einige erweiterte Funktionalitäten auszeichnet (QqLIT). Unter anderem kann in der anstatt Q3 verwendeten, verbesserten LIT-Version („Linear Accelerator Trap“) eine zusätzliche Fragmentierung vollzogen werden (Bild 5). Sie soll im Ionenfallen-Modus das Signal-zu-Rausch-Verhältnis (S/N) um den Faktor 10 bis 100 steigern können und beschleunigte „MRM3“-Experimente (MS3) erlauben. Dafür wird gezielt Stoßgas am Ende der LIT zudosiert (Bild 5, unten, blau) und eine zweite Fragmentierung durch CID eingeleitet, so dass auch das Produkt-Ion noch einmal gespaltet werden kann (M1 > M2 > M3). Im Idealfall können mit diesem zweiten Massenübergang störende Matrixsignale noch besser unterdrückt werden.

Obwohl die absolute Signalintensität im Vergleich zum klassischen MRM oft absinken kann, soll das entscheidende S/N gesteigert werden. MRMist meist nur dann zweckmäßig, wenn der übliche MRM-Übergang durch sichtbare Matrixpeaks oder großes Rauschen überlagert wird.

Fazit
Während in der GC-MS die Kombination aus Ionisierung und harter Fragmentierung in Form der EI dominiert, mussten für die sanften Ionisierungsmethoden der LC-MS neue Fragmentierungstechniken entwickelt werden. Als optimale Version hat sich die Kollisionszelle in der Mitte von Tandem-Massenspektrometern etabliert. Nur damit können Analyten selektiv ausgewählt und einer gezielten Fragmentierung zugeführt werden.

Nicht zuletzt deshalb leitete die Triple-Quadrupol-Technik, trotz lediglich niederauflösender Massenanalysatoren, den entscheidenden Durchbruch für die LC-MS/MS in der Spurenanalytik thermolabiler Analyten ein.

Wolfgang Brodacz
AGES Österreichische Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit Lebensmittelsicherheit – Kontaminantenanalytik, Linz
E-Mail: wolfgang.brodacz@ages.at

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