Instrumentelle Analytik

Mykotoxinanalytik in Bier

W. Brodacz, A. Raditschnig, A. Della Rosa*)

*) AGES Österreichische Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit Institut f. Lebensmittelsicherheit - Kontaminantenanalytik, Linz, E-Mail: wolfgang.brodacz@ages.at.

Klassisches Analysenschema für die GC-Analytik von A- und B-Trichothecenen (links bzw. rechts).

Bier ist ein häufig konsumiertes Getränk, das aufgrund seiner Ausgangsprodukte auch auf Schimmelpilzgifte untersucht wird, obwohl derzeit auf EU-Ebene keine Höchstwerte festgelegt sind. Ebenso existieren mit Ausnahme von Ochratoxin A keine offiziellen Analysenmethoden für den beliebten Gerstensaft. Daher wurden bewährte Methodenstrukturen aus der Zerealien-Routineanalytik an die Flüssigmatrix angepasst. Die klassische Mykotoxinanalytik setzt dabei auf die bewährte Kombination von spezifischem Clean up (Immunoaffinitäts-Säulen) mit selektiver Detektion in der LC und GC bis hin zur GC/MS.

Die Verwendung von Zerealien bei der Bierherstellung legt die Untersuchung auf Fusarientoxine nahe. Die laufend feststellbaren Belastungen von Gerste und Weizen mit B-Trichothecenen und der Pro-Kopf-Verbrauch von rund 100 l/Jahr machen eine Kontrolle des beliebten Getränks notwendig. Bei Gerste sind meist Deoxynivalenol (Leitsubstanz der B-Trichothecene) und Nivalenol, seltener 15-Acetyl-DON nachweisbar. Da Gerstenproben immer wieder auch mit Belastungen bei den A-Trichothecenen, T-2 Toxin u. HT-2 Toxin auffallen, wurde die Methode um eine Variante zur Bestimmung dieser hochtoxischen Fusarientoxine erweitert. Darüber hinaus muss davon ausgegangen werden, dass während der Keimungsphase des Mälzens und beim Maischen durch erneutes Pilzwachstum Toxine produziert werden können. Die Österreichische Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit (AGES) hat als Nationales Referenzlabor für Mykotoxine in Österreich seit 2008 begonnen, bestehende klassische Analysenmethoden für die Matrix Bier zu adaptieren.

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Trichothecene

Ziel der ersten Methodenentwicklung war der robuste Nachweis von fünf B- Trichothecenen (Deoxynivalenol, Nivalenol, Fusarenon X, 3-Acetyldeoxynivalenol und 15-Acetyldeoxynivalenol) bzw. der A-Trichothecene T-2 Toxin und HT-2 Toxin mit Bestimmungsgrenzen unter 10 bzw. 5 µg/kg Bier. Im Gegensatz zu Methoden, die üblicherweise auf einer Extraktion durch Flüssig/flüssig-Verteilung beruhen, wurde in Anlehnung an die bewährten, akkreditierten GC-Routinemethoden der AGES für Zerealien [1] eine direkte Festphasenextraktion (SPE) gewählt (Bild 1).

Unter Nutzung des Wasseranteils im Bier wurde daher durch Zugabe von Acetonitril genau jenes Verhältnis (84% CH3CN/16 % H2O) eingestellt, das für die SPE mit "MycoSep-227 Trich+" optimal ist. Dabei findet schon zum Großteil die Entgasung des Bieres statt. Das anschließende Rühren unterstützt die Eliminierung von CO2 und die Extraktion eventuell an Schwebeteilchen gebundener Zielanalyten bei trüben Produkten wie Zwickel und Weizenbieren. Innerhalb der üblichen Schwankungsbreiten von Wasser- und Alkoholgehalt in den diversen Biersorten bleibt die dadurch verursachte Abweichung unter 1 %. Bei der Festphasenextraktion mit den praktischen Einweg-Reinigungskartuschen der Fa. RomerLabs (Mischung von Aktivkohle, Silica, Ionenaustauscherharz, etc.) eluieren alle Trichothecene, während der Großteil der Matrixbestandteile zurückgehalten wird (Bild 2).

Nach der für B-Trichothecene notwendigen Derivatisierung mit "Tri-Sil TBT" erfolgt die Messung der silylierten Zielanalyten in bewährter Weise auf zwei GCs mit unterschiedlichen Phasenpolaritäten. Die B-Trichothecene zeigen aufgrund ihrer charakteristischen Carbonyl-Gruppe in Stellung C-8 im Gegensatz zu anderen halogenfreien organischen Verbindungen einen sehr starken Response im Electron-Capture-Detektor (ECD). Trotz dieses Selektivitätsvorteils muss für eine gute Nachweisempfindlichkeit der Methode angereichert werden. Insbesondere bei Bieren mit hohen Stammwürzegehalten kann es dadurch zu Störungen in den Chromatogrammen kommen. Wie bei der Zerealien-Routinemethode muss daher grundsätzlich auf zwei Säulen unterschiedlicher Polarität abgesichert werden. Die optimale Kombination der Polysiloxan-Phasentypen mit 35 % bzw. 5 % Phenylanteil ist das Ergebnis umfangreicher computergestützter Trennungsoptimierungen [2]. Bild 3 zeigt als analytischen "Worst Case" die ECD-Chromatogramme einer sehr matrixreichen, dunklen "Doppelmalz"-Bierprobe mit einer künstlichen Belastung von je ca. 30 µg/kg. Speziell bei dunklen und süßlichen Bieren wird deutlich, dass eine Verifizierung auf einer zweiten, unterschiedlichen Säulenpolarität für eine gesicherte Quantifizierung notwendig ist.

Stabilisotopenverdünnungs-GC/MS

Typ-A-Trichothecene zeigen durch die fehlende Carbonyl-Gruppe keinen gut nutzbaren ECD-Response. Man ist daher, wie auch in der HPLC mangels Chromophore, auf eine massenspektrometrische Detektion angewiesen. Im Falle der Targetanalyse hochtoxischer A-Trichothecene ist die relativ kostengünstige GC/MS eine durchaus sehr gute Lösung, da sie die Möglichkeit bietet, isotopenmarkierte interne Standards einzusetzen. Daher wurde eine gemeinsame SPE-Vorreinigung mit den B-Trichothecenen mit der Stabilisotopenverdünnungs-GC/MS (SIDA Stable Isotope Dilution Analysis) gewählt.

Zur Steigerung der Selektivität des Clean up kommt nach der SPE für die A-Trichothecene ein zweiter Reinigungsschritt mit Immunoaffinitätssäulen (IAC) zum Einsatz. Spezielle IACs binden die Zielanalyten T-2 Toxin und HT-2 Toxin gezielt an monoklonalen Antikörpern. Bei der Denaturierung der Bindung mit einem organischen Lösungsmittel (Methanol, Acetonitril, etc.) kommt es abschließend zur Elution der Toxine. Besonders bei einer Matrix wie Bier, die einen sehr hohen wässrigen Anteil aufweist, können auch größere Mengen auf der IAC angereichert werden. Wird das Elutionsvolumen möglichst gering gehalten, kann eine entsprechende Aufkonzentrierung des gereinigten Toxinextraktes erzielt werden (Bild 4).

Für die notwendige Derivatisierung wird eine Silylierung mit N-methyl-N-trimethylsilyl-trifluoroacetamid (MSTFA) mit 1 % Trimethylchlorosilan (TMCS) eingesetzt, die sich schon in der Dopinganalytik bewährt hat. Der Hauptvorteil liegt in der gleichzeitigen Verwendung von MSTFA als Silylierungsmittel und als Lösungsmittel bei der Splitless-Druckpulsinjektion. D.h. die übliche Hydrolyse des Reagenzüberschusses und anschließende, aufwändige Reextraktion der umgesetzten Toxine in ein organisches Lösungsmittel entfällt.

Eine entscheidende Voraussetzung für hohe Qualität bei der Quantifizierung nach komplexer Aufarbeitung sind interne Standards (IStd), die sofort nach der Extraktion zugegeben werden (Bild 1 oben). Damit sind alle kritischen Schritte (SPE, IAC, Derivatisierung, GC-Probenaufgabe) unter Kontrolle. Isotopenmarkierte Zielanalyten wie die vollständig 13C-markierten Toxine sind die idealen internen Standards in der massenspektrometrischen Mykotoxinanalytik. Sie zeichnen sich durch praktisch gleiche physikalisch/chemische Eigenschaften verglichen mit den nativen Toxinen aus [3].

Wird wie in der vorliegenden Methode für jeden Zielanalyten das jeweils voll 13C-markierte Analoge als interner Standard eingesetzt, kompensiert es praktisch alle Schwankungen und Verluste der gesamten Analysenmethode. Mit dieser Stabilisotopenverdünnungsanalytik wird somit ein Optimum an quantitativer Verifizierung gewährleistet. Bei den relativ kostspieligen 13C-markierten Mykotoxinen können durch ein entsprechend angepasstes Methodendesign (Aliquotierungen nur am Anfang der Methode vor der IStd-Dotierung; Minimierung des Messlösungsvolumens, etc.) deutliche Einsparungen erzielt werden [4]. Nach einer Empfehlung der EU (2002/657/EC) sind für Mykotoxine ("Gruppe B" in Annex I in 96/23/EC) drei sogenannte Identifizierungspunkte (IP) für Bestätigungsanalysen vorgesehen. Bei der GC/MS gilt ein SIM-Ion (Selected Ion Monitoring) als ein Identifizierungspunkt.

Die selektive Messung von je drei diagnostischen Ionen pro Zielanalyt erfüllt diese Richtlinie und resultiert in einer Bestimmungsgrenze von rund 4,5 µg/kg für T-2 Toxin bzw. HT-2 Toxin (Bild 5). Während für die Zielanalyten T-2 Toxin bzw. HT-2 Toxin je ein Target mit zwei Qualifiern gemessen werden, würde theoretisch für die internen isotopenmarkierten Standards ein diagnostisches Ion (Target) ausreichen. Da sich aber die gesamte Quantifizierung auf dieses eine Signal bezieht, wird aus Sicherheitsgründen zusätzlich ein Qualifierion gemessen (Bild 5 unten). So kann über deren Verhältnis kontrolliert und dokumentiert werden, dass das Quantifizierungs-Chromatogramm (Target) des internen Standards nicht durch die Matrix gestört wird [5].

Für eine GC/MS-Absicherung der B-Trichothecene DON, NIV und 3AcDON stehen ebenfalls die voll 13C-gelabelten internen Standards zur Verfügung. Bild 6 zeigt die SIM-Spuren für eine SIDA-Verifizierung der Trichothecen-Leitsubstanz DON.

Ochratoxin A

Es gibt mehrere Gründe, Ochratoxin A (OTA) in Bier zu analysieren. Auf legislativer Ebene wird OTA in der EU-Verordnung Nr. 1881/2006 mit Bier in Verbindung gebracht. Im Gegensatz zu Wein ist jedoch dzt. noch kein OTA-Höchstwert für den Gerstensaft in Kraft. Auf praktischer Ebene besteht die Erfahrung aus der Futtermittelanalytik, dass fallweise erhöhte OTA-Werte bei diversen Kleieprodukten gemessen werden. Nachdem Braumalz ebenso zu großen Anteilen Schalenbestandteile des Getreides enthält, ist nicht auszuschließen, dass bei Verwendung kontaminierten Getreides erhebliche Mengen des Toxins in das Endprodukt Bier gelangen. Im Maische- bzw. Läuterverfahren ist in der Regel eine möglichst effiziente Auslaugung der Trebern erwünscht. Die gute Löslichkeit von OTA in wässrigen Lösungen begünstigt den Transfer über die Würze in das Bier.

Hinsichtlich der analytischen Methode fällt die Entscheidung leicht: Es besteht mit der EN14133 eine gültige europäische Norm für Ochratoxin A in Wein und Bier und daher wurde diese angewandt. Nach diesem Verfahren wird das entgaste Bier mit derselben Menge einer wässrigen Polyethylenglycol/Natriumhydrogencarbonatlösung verdünnt und auf eine OTA-selektive Immunoaffinitätssäule aufgetragen. Das große Auftragsvolumen begünstigt eine wesentlich niedrigere Nachweis- und Bestimmungsgrenze als das z.B. bei unpolaren Extrakten fester Proben möglich ist. Da sich die Fluoreszenz-Detektion für die HPLC-Messung von OTA besonders gut eignet, wird die Sensitivität der Methode durch Auswahl einer selektiven Anregungs- und Emissionswellenlänge noch einmal verbessert. Der Einfluss störender Begleitsubstanzen im Chromatogramm (Störpeaks) hält sich dabei selbst bei sehr geringen OTA-Konzentrationen in Grenzen (Bild 8).

Fumonisine

Fumonisine werden zwar seltener in Gerste gefunden, sondern hauptsächlich in Maisprodukten. (z.B. Maisgrits). Diese können gemäß Österreichischem Lebensmittelbuch (Codexkapitel B13) als Rohfrucht immerhin bis zu einem Ausmaß von 25 % zur Ergänzung der Maische beigemischt werden. Wie bei OTA, besteht auch hier die Gefahr, dass Fumonisine durch völlige Auslaugung in die Würze gelangen. Für die Matrix Bier gibt es derzeit keine gültige Fumonisine-Normmethode. DASKO et al. beschreiben eine Methode [6], in der in ähnlicher Weise wie bei der EN14133 eine verdünnte Bier/Lösungsmittelmischung auf eine Immunoaffinitätssäule aufgetragen wird. Anstatt der Verdünnungslösung wird in diesem Fall PBS-Buffer (Phosphate Buffered Saline; phosphatgepufferte Salzlösung) verwendet.

Fumonisine sind mit LC-Standarddetektoren nicht empfindlich erfassbar, daher ist eine Derivatisierung erforderlich. Um den sehr sensitiven Fluoreszenzdetektor (FLD) nutzen zu können, wurde zu Gunsten einer automatisierten Vorsäulenderivatisierung mit OPA (o-Phthaldialdehyd) im Autosampler entschieden. Das verbessert auch die Chromatographierbarkeit der ansonsten zu Tailing und Adsorption neigenden nativen Fumonisine. Die Anzahl von Störpeaks ist bei der Fumonisin-Analytik aber deutlich höher als bei der OTA-Methode. In eigenen Validierungsstudien konnte allerdings gezeigt werden, dass unter den verwendeten HPLC-Bedingungen eine ausreichende Trennung von Matrix-Peaks und Zielanalyten gewährleistet ist (Bild 9).

In der Tabelle sind die Methodenkenndaten der angewandten Bier-Analytik mit den Nachweis- und Bestimmungsgrenzen (NG; BG) sowie den bei der Validierung ermittelten Rückgewinnungsraten und Variationskoeffizienten angeführt. Soweit von der EU geregelt, sind ihnen die erforderlichen konzentrationsabhängigen Leistungskriterien gegenübergestellt. Bei den B-Trichothecenen gibt es nur für die Leitsubstanz DON in Zerealien vorgegebene Sollkriterien. Diese wurden daher auch für die anderen miterfassten B-Trichothecene angewandt.

Die Ermittlung der Methodenkenndaten wurde bei den Trichothecenen z.B. mit den Biertypen Alkoholfrei, Leicht, Pils, Vollbier, Doppelmalz, Hefeweizen hell und Hefeweizen dunkel durchgeführt. Verglichen mit bisher publizierten GC- und LC-Methoden können die Bestimmungsgrenzen als zufriedenstellend bezeichnet werden. Die Vorgaben der EU-Verordnung 401/2006, sowie die EU-Richtlinie 2002/657/EC werden bei allen Zielanalyten erfüllt.

Entwarnung - Geringe Kontaminationen

Mykotoxine in Bier können für Lebensmittelkontrollen in Österreich seit 2008 routinemäßig von der AGES untersucht werden. Allein 2012 wurden 160 Biere unterschiedlicher Typen analysiert. Belastungen mit Schimmelpilzgiften über den Bestimmungsgrenzen (BG) konnten nur in wenigen Fällen nachgewiesen werden. Bei Desoxynivalenol lagen 13 Biere über der BG, davon sind drei Proben mit Gehalten zwischen 100...126 µg/kg aufgefallen, drei weitere zeigten Belastungen um 50 µg/kg. Ebenfalls in drei Fällen war Nivalenol mit 20...24 µg/kg über der Bestimmungsgrenze. Nur ein einziges Bier war mit nennenswerten Belastungen mit A-Trichothecenen vertreten (HT-2 Toxin: 10 µg/kg und T-2 Toxin: 4 µg/kg). Die hohe Nachweisempfindlichkeit von Ochratoxin A zeigte sich in 92 Quantifizierungen (> BG), wobei 0,16 µg/kg den höchsten Wert markierte. Wie zu erwarten, konnte Fumonisin B1 nur ein einziges Mal - und das auch nur unter der BG - nachgewiesen werden. Die Ergebnisse sind im Einklang mit bisherigen Erhebungen am europäischen Markt [7, 8, 9, 10] und können bei moderatem Bierkonsum Großteils als unkritisch bezeichnet werden.

Literatur

  • [1] Brodacz W.: "Langzeiterfahrungen in der GC-Routineanalytik von Mykotoxinen"; LaborPraxis LP 7/8, S 32 - 34; August 2005.
  • [2] Brodacz W.:, "Auswahl von GC-Phasen und Optimierung von Trichothecen-Trennungen mittels Computersimulation"; Mycotoxin Research Vol. 21, No. 1, S11-14, 2005.
  • [3] Brodacz W.: "Isotopenverdünnungsanalytik von Mykotoxinen mit GC/MSD", LaborPraxis LP 9, S 46 - 49; September 2007.
  • [4] Brodacz W.: "Kostenreduktion in der Stabilisotopenverdünnungsanalytik - Qualität verbessern und trotzdem sparen (Teil 1)", Chemiereport.at 4/2011; S 54-55 ; Juni 2011.
  • [5] Brodacz W.: "Hochtoxische Mykotoxine genau quantifizieren", LaborPraxis LP 10, S 72 - 769; Oktober 2008.
  • [6] Dasko L., Rauova D., Belajova E., Kovac M.: "Determination of Fumonisins B1 and B2 in Beer"; Czech J. Food Sci., 23: 20-26; 2005.
  • [7] Anselme M., Tangni E.K., Pussemier L., Motte J.C., Van, Hove F., Schneider Y.J., Van Peteghem C., Larondelle Y.: "Comparison of ochratoxin A and deoxynivalenol in organically and conventionally produced beers sold on the Belgian market"; Food Addit Contam. 23(9):910-918; 2006.
  • [8] Kostelanska M., Hajslova J., Zachariasova M., Malachova A., Kalachova K., Poustka J., Fiala J., Scott P.M., Berthiller F., Krska R.: "Occurrence of deoxynivalenol and ist major conjugate, deoxynivalenol-3-glucoside, in beer and some brewing intermediates"; J. Agric. Food Chem. 57(8):3187-3194; 2009.
  • [9] Bertuzzi T., Rastelli S., Mulazzi A., Donadini G., Pietri A.: "Mycotoxin occurrence in beer produced in several European countries"; Food Control. 22(12):2059-2064; 2011.
  • [10] Varga E., Malachova A., Schwartz H., Krska R. & Berthiller F.: "Survey of deoxynivalenol and its conjugates deoxynivalenol-3-glucoside and 3-acetyldeoxynivalenol in 374 beer samples", Food Additives & Contaminants: Part A 1-10, 2012.
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